UNIVERZÁLNÍ SEKVENOVÁNÍ TELL-Seq Target Enrichment

Specifikace:

• Název produktu: TELL-SeqTM Target Enrichment
• Pro: Pouze pro výzkumné použití, nikoli pro diagnostické postupy
• Výrobce: Universal Sequencing Technology Corporation
• Požadovaná genomová DNA: 5 ng
• Podmínky skladování: Tris pufr pH 7.5-8.0 nebo nízký TE pufr

Návod k použití produktu

Doporučení pro vstup genomové DNA:
Ujistěte se, že máte alespoň 5 ng genomové DNA pro protokol. Vysoká molekulová hmotnost DNA je zásadní pro úspěšné sekvenování. Kvantifikujte DNA pomocí fluorometrické metody, jako je Qubit dsDNA BR Assay Kit nebo HS Kit. Před měřením nařeďte koncentrovanou DNA na pracovní koncentraci (0.4 ng/l až 1 ng/l) v pufru Tris. Uchovávejte genomickou DNA v Tris pufru s pH 7.5-8.0 nebo s nízkým TE pufrem.

Obsah sady:

TELL-SeqTM Library Prep Kit, standardní velikost se skládá ze dvou krabice:

• Rámeček 1: Obsahuje různé reagencie včetně Barcoding Enzyme, Exonuclease a dalších.
• Rámeček 2: Obsahuje TELL Bead Plexb, promývací roztok a zastavovací roztok.

Poznámka: Činidla z krabice 1 nezmrazujte a nerozmrazujte více než 6krát.

FAQ:

1. Otázka: Mohu k tomu použít jiné metody než fluorometrické? kvantifikovat DNA?
   Odpověď: Pro přesné měření se doporučuje použít fluorometrickou metodu, jako je Qubit dsDNA BR Assay Kit nebo HS Kit. Vyhněte se metodám, které měří pouze celkovou koncentraci nukleové kyseliny.
2. Otázka: Jak bych měl uchovávat genomovou DNA pro optimální výsledky?
   Odpověď: Pro dosažení nejlepších výsledků by měla být genomická DNA skladována v Tris pufru s pH v rozmezí 7.5 – 8.0 nebo v pufru s nízkým TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0).

Pouze pro výzkumné účely. Nepoužívat v diagnostických postupech.
Dokument č. 100032-USG v4.0
srpna 2024
Tento dokument je majetkem společnosti Universal Sequencing Technology Corporation a je určen výhradně pro použití jejím zákazníkem ve spojení s použitím zde popsaných produktů a pro žádné jiné účely. Pokyny v tomto dokumentu musí přesně dodržovat řádně vyškolený personál, aby bylo zajištěno správné a bezpečné používání soupravy TELL-Seq™.
UNIVERSAL SQUENCING TECHNOLOGY CORPORATION NEPŘEBÍRÁ ŽÁDNOU ODPOVĚDNOST, KTERÁ VZNIKNE PO NESPRÁVNÉM POUŽITÍ TELL-SEQ™ KIT.
©2023 Universal Sequencing Technology Corporation. Všechna práva vyhrazena. TELL-Seq™ je ochranná známka společnosti Universal Sequencing Technology Corporation. Všechny ostatní názvy, loga a další ochranné známky jsou majetkem příslušných vlastníků.

Historie revizí

Dokument č. 100032-USG v1.0	listopadu 2021	Počáteční vydání
Dokument č. 100032-USG v2.0	srpna 2022	Aktualizace protokolu pro práci s aktualizovanou sadou TELL-Seq™ Library Prep Kit V1 s možností Suspension Buffer EZ a TELL Bead Plex
Dokument č. 100032-USG v3.0	srpna 2023	Odebrána možnost TELL Bead. Při pohybu vpřed se používá pouze TELL Bead Plex. Přidána poznámka a obrázek s doporučenými míchacími systémy pro kritický krok správné rotace zkumavek během procesu čárového kódu, aby se zachovaly vlastnosti DNA s vysokou molekulovou hmotností.
Dokument č. 100032-USG v4.0	srpna 2024	Změněná uživatelská příručka pro obecné obohacování cíle. Přidány další informace o používání TELL-Seq™ Library Prep s jinými systémy Target Enrichment

Zavedení

Tento protokol vysvětluje, jak připravit cílové obohacené indexované knihovny TELL-Seq™ s párovým koncem hybridizačním zachycením pomocí kombinace sady TELL-Seq™ Library Prep Kit a systému Agilent® SureSelect Target Enrichment System. Systém TELL-Seq™ Library Prep Kit je také kompatibilní s dalšími systémy Target Enrichment, jako jsou IDT a Twist Biosciences.
Přípravná sada knihovny TELL-Seq™ využívá inovativní technologii Transposase Enzyme Linked Long-read Sequencing (TELL-Seq™)† k přípravě knihovny s párovým koncem pro generování čtení spojených s čárovým kódem ze sekvenačního systému Illumina®. Agilent® SureSelect Target Enrichment System umožňuje obohacení cílových oblastí pomocí vysoce specifických záchytných sond. Každý Target Enrichment System má jedinečný panel sond, které umožňují zachytit specifické oblasti, které jsou kompatibilní s knihovnami TELL-Seq™.

Doporučení pro vstup genomové DNA
Pro tento protokol je vyžadováno 5 ng genomové DNA. DNA s vysokou molekulovou hmotností (HMW) je rozhodující pro úspěšné sekvenování TELL-Seq™.

• Pro lidský genom je minimální sampVelikost DNA by měla být větší než 40 kb.
•  HMW DNA ranging from 100Kb to 300Kb are optimal material for best human phasing application.
• Vyvarujte se rozbití HMW DNA během manipulace. Odstraňte nízkomolekulární DNA (identifikovanou jako nátěr menší než 10 kb na gelu) v sample pokud představují významnou část v DNA sample.

Ke kvantifikaci vstupní DNA použijte fluorometrickou metodu. Pokud používáte Qubit dsDNA BR Assay Kit nebo HS Kit, použijte alespoň 2 µl každé DNA sample pro měření. Vyhněte se metodám, které měří pouze celkovou koncentraci nukleových kyselin, jako je NanoDrop nebo jiné metody UV absorbance. Pro přesné měření koncentrace HMW DNA nařeďte koncentrovanou DNA na pracovní koncentraci (0.4 ng/µl až 1 ng/µl) v Tris pufru (pH 7.5-8.0) několik hodin až den před měřením koncentrace a přípravou knihovny. Genomická DNA by měla být skladována v Tris pufru s pH v rozmezí 7.5 – 8.0 nebo v pufru s nízkým TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). Pro posouzení čistoty DNA sample lze použít poměr měření absorbance při 260 nm k absorbanci při 280 nm. Tento protokol je optimalizován pro DNA s hodnotami absorbančního poměru 1.8–2.0. Pokud je v DNA nadměrné množství RNAample, měla by být odstraněna ošetřením RNázou.

Obsah sady

TELL-Seq™ Library Prep Kit, standardní velikost (2 krabice)

Pole 1 ze 2: TELL-Seq™ Library Reagent Box 1 V1 (PN 100035)

POZNÁMKA: Činidla z krabice 1 nezmrazujte a nerozmrazujte více než 6krát.

a Pro použití s ​​10× Primer II v sadě TELL-Seq™ Library Multiplex Primer Kit společně pro knihovnu ampzvedání.

Krabice 2 ze 2: Krabice reagencií TELL-Seq™ Library 2 V1 (PN 100036)

Název součásti	Barva čepice	Hlasitost (ml)	Skladovací teplota
TELL Bead Plexb	CAP Orange	76	2 °C až 8 °C
Promývací roztok	CAP Bílá	4500	2 °C až 8 °C
Zastavte řešeníc	CAP Přírodní	960	2 °C až 25 °C

b TELL Bead Plex funguje dobře na sekvenčních systémech Illumina i non-Illumina.
c Pokud stop roztok není čirý nebo obsahuje bílé sraženiny, před použitím zahřejte zkumavku na 37C. Vortexujte, abyste rozpustili případnou sraženinu. Po prvním použití uchovávejte resuspendovaný stop roztok při pokojové teplotě pro budoucí použití.

POZOR

 Pro analýzu sekvenačních dat generovaných z knihoven TELL-Seq™ připravených pomocí TELL Bead Plex je vyžadován TELL-Read pipeline v1.1 nebo vyšší.

TELL-Seq™ Library Prep Kit, HT24 (2 boxy)
Krabice 1 ze 2: Krabice reagencií TELL-Seq™ Library 1 V1, HT24 (PN 100037) 

POZNÁMKA: Činidla z krabice 1 nezmrazujte a nerozmrazujte více než 6krát. 

a Pro použití s ​​10× Primer II v sadě TELL-Seq™ Library Multiplex Primer Kit společně pro knihovnu ampzvedání.

Krabice 2 ze 2: Krabice reagencií TELL-Seq™ Library 2 V1, HT24 (PN 100038)

Název součásti	Barva čepice		Objem	Skladovací teplota
TELL Bead Plexb	Pomerančový		456 ml	2 °C až 8 °C
Promývací roztok		Modrý	28.5 ml	2 °C až 8 °C
Zastavte řešeníc		Bílý	5.76 ml	2 °C až 25 °C

b TELL Bead Plex funguje dobře na sekvenčních systémech Illumina i non-Illumina.
c Pokud stop roztok není čirý nebo obsahuje bílé sraženiny, před použitím zahřejte zkumavku na 37 ºC. Vortexujte, abyste rozpustili případnou sraženinu. Po prvním použití uchovávejte resuspendovaný stop roztok při pokojové teplotě pro budoucí použití.

PRO TIP: DVĚ sady TELL-Seq™ Library Prep Kit, HT24 včetně boxu 1 a boxu 2 lze spárovat s jakýmikoli sadami primerů TELL-Seq™ Library Multiplex Primer Kit.

POZOR 
Pro analýzu sekvenačních dat generovaných z knihoven TELL-Seq™ připravených pomocí TELL Bead Plex je vyžadován TELL-Read pipeline v1.1 nebo vyšší.

Sada TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (1-8) (PN 100003)

PRO TIP: Jedna sada TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (1-8) obsahuje dostatek primerů pro použití se ČTYŘMI sadami TELL-Seq™ WGS Library Prep Kit.

Sada TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (9-16) (PN 100009)

PRO TIP: ONE TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (9-16) Kit obsahuje dostatek primerů pro použití se ČTYŘMI TELL-Seq™ WGS Library Prep Kit, standardní velikost.

Sada TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (17-24) (PN 100010)

PRO TIP: ONE TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (17-24) Kit obsahuje dostatek primerů pro použití se ČTYŘMI TELL-Seq™ WGS Library Prep Kit, standardní velikost.

Sada TELL-Seq™ Illumina® Sequencing Primer Kit (PN 100004)

Název součásti	Barva čepice	Koncentrace	Hlasitost (ml)	Skladovací teplota
Přečtěte si 1 Primer	Černý	100mM	50	-25 °C až -15 °C

Přečtěte si 2 Primer	Bílý	100mM	50	-25 °C až -15 °C
Index 1 Základní nátěr	Červený	100mM	50	-25 °C až -15 °C
Index 2 Základní nátěr	Žluť	100mM	50	-25 °C až -15 °C

TELL-Seq™ Target Blocker (PN 100019)

Název součásti	Barva čepice	Hlasitost (ml)	Skladovací teplota
TELL-Seq™ Target Blocker	CAP Bílá	40	-25 °C až -15 °C

Spotřební materiál a vybavení (není součástí dodávky)

Spotřební materiál

Spotřební materiál	Dodavatel
0.2 ml PCR zkumavka nebo stripová zkumavka	Generální dodavatel laboratoří
20ml špička pipety (standardní a široký otvor)	Generální dodavatel laboratoří
200ml špička pipety (standardní a široký otvor)	Generální dodavatel laboratoří
Ethanol 200 proof (absolutní) pro molekulární biologii (500 ml)	Sigma-Aldrich, # E7023
Voda bez nukleázy	Generální dodavatel laboratoří
AMPurčitě XP	Beckman, # A63880
Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Kit*	Agilent, # 5067-4626
TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Test*	Agilent, #5067-5592, #5067-5593
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, # Q32851 nebo Q32854
Zkumavky Qubit	Thermo Fisher Scientific, # Q32856
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Thermo Fisher Scientific, # 65601, 65602 nebo 65603
Agilent SureSelect XT HS Capture Library Human All Exon 7	Agilent, # G9704N, G9705N nebo G9706N
Agilent SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module (Post PCR), 16 Rxn	Agilent, #G9916B
TE pufr, pH 8.0	Generální dodavatel laboratoří

*Závisí na tom, který systém je k dispozici v uživatelském zařízení.

Zařízení

Zařízení	Dodavatel
Termocykler	Aplikované biosystémy
Magnetický stojan pro 0.2 ml PCR zkumavky	Generální dodavatel laboratoří
Trubkový rotátor	Generální dodavatel laboratoří
Inkubátor (pro 35°C)	Generální dodavatel laboratoří
Vortexer	Generální dodavatel laboratoří
Mikrocentrifuga	Generální dodavatel laboratoří
Bioanalyzátor Agilent*	Agilent
Agilent TapeStation*	Agilent
Fluorometr Qubit® 3.0	Thermo Fisher Scientific, # Q33216, Q33217 nebo Q33218
Kbelík na led	Generální dodavatel laboratoří
Vakuové koncentrátory SpeedVac (volitelné)	Thermo Fisher Scientific

*Závisí na tom, který systém je k dispozici v uživatelském zařízení.

Pracovní postup zachycování lidských exomů TELL-Seq™

Příprava knihovny TELL-Seq™ WGS

Protokol

Příprava knihovny TELL-Seq™ WGS
Následující protokol popisuje modifikovaný postup přípravy sekvenační knihovny celého genomu TELL-Seq™ pomocí sady TELL-Seq™ Library Prep s použitím lidské DNAamples. Různé genomové DNAampTypy souborů lze také nahradit podle stejného protokolu. Knihovny TELL-Seq™ jsou kompatibilní s jinými systémy Target Enrichment, ale systém Agilent SureSelectXT HS Target Enrichment System využívající SureSelect Human All Exon V8 capture sondy se používá jako ex.ample v protokolu. Pro použití v jiných systémech Target Enrichment Systems postupujte podle protokolu pro přípravu knihovny TELL-Seq™ (str. 10-22), abyste vygenerovali vhodné knihovny. Knihovny TELL-Seq™ lze použít jako vstup DNA podle protokolu každého specifického systému obohacování cíle spolu s blokátory cíle TELL-Seq™, které se používají jako doplněk ke specifikovaným blokátorům.

Čárový kód DNA

Spotřební materiál
➢ Vstup genomové DNA (uživatel)

Velikost genomu	Vstupní částka	Reaction Vol (ml)	Přípravky/sada
Velký (lidský)	5 ng	150	4

POZNÁMKA: 

1. Genomická DNA by měla být skladována a naředěna v Tris pufru s pH v rozmezí 7.5 až 8.0 nebo v pufru s nízkým TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0).

➢ 5× reakční pufr (Kit Box 1, Modrý)
➢ Cofactor II (Kit Box 1, Jantar)
➢ Enzym čárových kódů (balíček 1, Černý)
➢ TELL Bead nebo TELL Bead Plex (balení sady 2, Oranžový)
➢ Suspension Buffer EZ (Kit Box 1, Přírodní)
➢ voda bez nukleázy (uživatel)
➢ 0.2 ml PCR zkumavka nebo stripovací zkumavka (uživatel)
➢20 µL a 200 µL široké pipetové špičky (uživatel)

Příprava

1. Připravte si následující spotřební materiál:
   

   Položka	Skladování	Návod
   5× reakční pufr	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Vortexujte a promíchejte   krátce odstředit. Zůstaňte na ledě.
   Kofaktor II	-25 °C až -15 °C	Vortexujte pro promíchání a poté krátce odstřeďte. Držte se pokojová teplota ve tmě. Uzavřete trubici   po každém použití pevně uzavřete.
   Enzym pro čárové kódy	-25 °C až -15 °C	Švihněte zkumavkou 4 až 5 krát, aby se směs promíchala. Odstředivka krátce. Zůstaňte na ledě.
   TELL Bead Plex	2 °C až 8 °C	Krátce centrifugujte. Zůstaňte na ledě. Zavřete uzávěr zkumavky  těsně po každém použití aby nedošlo k odpařování.
   Suspenzní pufr EZ	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Vortexujte pro promíchání a poté krátce odstřeďte. Držte se pokojová teplota.
   Voda bez nukleázy	Pokojová teplota	Uchovávejte při pokojové teplotě.

2. Nastavte rotátor zkumavek do inkubátoru s teplotou 35 °C (viz krok 7 v části Postup).

POZOR
K přenosu a míchání genomové DNA s vysokou molekulovou hmotností používejte špičky pipet se širokým otvorem, aby nedošlo k porušení DNA. Pokud nejsou k dispozici špičky pipet se širokým otvorem, před použitím odřízněte 2 mm-3 mm od špičky standardní pipety čistou žiletkou.

Postup

1. Vortexujte TELL Bead Plex energicky po dobu alespoň 30 sekund. Pulzní rotaci (odstřeďujte ne déle než 1 sekundu), aby se roztok kuliček přítomný na víčku nebo stranách zkumavky snížil. Těsně před použitím napipetujte TELL Bead Plex špičkou 200 µl nahoru a dolů 5krát nahoru a dolů, abyste se ujistili, že jsou všechny kuličky správně resuspendovány.
2. V 0.2 ml zkumavce PCR sestavte každou reakci v následujícím pořadí.
   

   Činidlo	Objem na reakci (ml)
   	Velký genom (150 ml)

   5× reakční pufr	30
   Voda bez nukleázy Kofaktor II	20 – Z (Z je objem DNA)30
   TELL Bead Plex (0.5 milionu čárových kódů/ml)	19

3. Dobře promíchejte 10x pipetováním nahoru a dolů nebo intenzivním vortexováním po dobu 5 sekund a pulzním odstřeďováním, aby se roztok dostal na dno. Přidejte enzym pro čárové kódy.
   

   Činidlo	Objem na reakci (ml)
   	Velký genom
   Enzym pro čárové kódy	6 ml

4. Dobře promíchejte 8x pipetováním nahoru a dolů. Zabraňte vniknutí vzduchových bublin při pipetování tím, že budete držet špičku pipety na dně roztoku ve zkumavce.
5. Použijte špičku pipety se širokým otvorem a přidejte následující činidlo.
   POZNÁMKA: Suspension Buffer EZ je vysoce viskózní. Buďte opatrní a pipetujte pomalu, abyste se ujistili, že je aplikován správný objem.
6. Nastavte objem pipety na 110 µL. Použijte špičku pipety se širokým otvorem, jemně promíchejte roztok pomalým pipetováním nahoru a dolů 6-8krát. Při pipetování se vyhněte vnášení mnoha vzduchových bublin tím, že budete držet špičku pipety na dně roztoku ve zkumavce.
7. Umístěte sampPoložte zkumavku na rotátor zkumavek v inkubátoru při 35 °C a pomalu otáčejte (10-15 ot./min.) po dobu 30 minut.

Sampzkumavky umístěné na rotátoru zkumavek v inkubátoru při 35 °C.

Poznámka: Správná rotace zkumavek je rozhodující pro zachování vlastností HMW DNA a pro usnadnění správného procesu čárového kódu. Doporučené směšovací systémy jsou uvedeny níže (levá strana). Míchací systémy, které se neotáčejí nebo které generují intenzivní protřepávání, jsou neslučitelné se zachováním vlastností HMW DNA a TELL-Seq; některé z těchto systémů jsou také zobrazeny níže (pravá strana).

Stabilizovat DNA 

Spotřební materiál
➢ Stabilizátor (Kit Box 1, Fialový)

Příprava

1. Připravte si následující spotřební materiál:

Položka	Skladování	Návod
Stabilizátor	-25 °C až -15 °C	Švihněte zkumavkou 4 až 5 krát, aby se směs promíchala. Krátce centrifugujte. Zůstaňte na ledě.

Postup

1. Získejte sampvyjměte zkumavku z inkubátoru při 35 °C.
2. Přidejte stabilizátor do zkumavky.
   

   Činidlo	Objem na reakci (ml)
   	Velký genom
   Stabilizátor	3

3. Nastavte objem pipety na 110 µL. Použijte špičku pipety se širokým otvorem, jemně promíchejte roztok pomalým pipetováním nahoru a dolů 6-8krát. Vyhněte se vytváření mnoha bublin.
4. Umístěte sampPoložte zkumavku zpět na rotátor zkumavek v inkubátoru při 35 °C a pomalu s ní otáčejte (10-15 ot./min.) po dobu 30 minut.

Tagmentální DNA 

Spotřební materiál
➢ TagGing Enzyme (Kit Box 1, Červené)
➢ Exonukleáza (Kit Box 1, Žlutá)

Příprava

1. Připravte si následující spotřební materiál:
   

   Položka	Skladování	Návod
   TagGing Enzym	-25 °C až -15 °C	Švihněte zkumavkou 4 až 5 krát, aby se směs promíchala. Odstředivka krátce. Zůstaňte na ledě.
   Exonukleáza	-25 °C až -15 °C	Švihněte zkumavkou 4 až 5 krát, aby se směs promíchala. Odstředivka krátce. Zůstaňte na ledě.

2. Použijte stejný rotátor zkumavek v inkubátoru při 35 °C.

Postup

1. Získejte sampvyjměte zkumavku z inkubátoru při 35 °C.
2. Přidat Tagenzymu a exonukleázy do zkumavky.
   

   Činidlo	Objem na reakci (ml)
   	Velký genom
   TagGing Enzym	2
   Exonukleáza	3

3. Nastavte objem pipety na 110 µL. Použijte špičku pipety se širokým otvorem, jemně promíchejte roztok pomalým pipetováním nahoru a dolů 8krát. Pro tento krok musí být míchání velmi důkladné. Vyhněte se vytváření mnoha bublin.
4. Umístěte sampVložte zkumavku zpět na rotátor zkumavek v inkubátoru při 35 °C a pomalu s ní otáčejte po dobu 10 minut. V případě potřeby různé množství Tagging Enzyme lze použít k úpravě velikosti knihovny.
   POZNÁMKA: Pokud je preferována delší knihovna vložek, menší množství TagV reakci lze použít ging Enzym. Na druhou stranu, pokud je preferována kratší knihovna inzertů, až 6 µl TagV reakci lze použít enzymy.
5. Ihned po inkubaci pokračujte dalším krokem.

Umyjte korálky

Spotřební materiál

• Zastavovací roztok (Box 2, Přírodní nebo skladované při pokojové teplotě po prvním použití)
• Promývací roztok (Kit Box 2, Bílý)
• 0.2 ml PCR zkumavka nebo stripová zkumavka (uživatel)

Příprava

1. Připravte si následující spotřební materiál:
   

   Položka	Skladování	Návod
   Zastavte řešení	2 °C až 25 °C	Zkontrolujte případné sraženiny. Pokud je přítomen, inkubujte pufr při 37 °C po dobu 10 minut a vortexujte, dokud se nerozpustí. Skladujte při pokojové teplotě pro  budoucí použití.
   Promývací roztok	2 °C až 8 °C	Přiveďte na pokojovou teplotu.

2. Nastavte termocykler s následujícím programem:
   • Možnost předehřátí víka na 100 °C
   • 63°C navždy

Postup

1. Umístěte sampPonechte zkumavku na magnetickém stojanu po dobu 1 minuty nebo dokud není roztok čirý.
2. Zatímco je zkumavka na magnetickém stojanu, odsajte a zlikvidujte supernatant bez rušivých kuliček.
3. Vyjměte trubici z magnetického stojanu. Přidejte 120 µl promývacího roztoku do sample trubice. Pipetujte, aby se kuličky znovu suspendovaly. V případě potřeby pulsujte, aby se roztok snížil.
4. Umístěte sampPoložte zkumavku zpět na magnetický stojan na 1 minutu nebo dokud nebude roztok čirý.
5. Zatímco je zkumavka na magnetickém stojanu, odsajte a zlikvidujte supernatant bez rušivých kuliček.
6. Vyjměte trubici z magnetického stojanu. Přidejte 80 µl stop roztoku do zkumavky.
7. Několikrát pipetujte, aby se kuličky znovu suspendovaly. V případě potřeby pulsujte, aby se roztok snížil.
8. Inkubujte zkumavku při pokojové teplotě po dobu 5 minut.
9. Umístěte sampPoložte zkumavku zpět na magnetický stojan na 1 minutu nebo dokud nebude roztok čirý.
10. Zatímco je zkumavka na magnetickém stojanu, odsajte a zlikvidujte supernatant bez rušivých kuliček.
11. Vyjměte trubici z magnetického stojanu. Přidejte 120 µl promývacího roztoku do zkumavky PCR. Pipetujte, aby se kuličky znovu suspendovaly.
12. Přeneste všechen roztok kuliček do nové 0.2ml zkumavky PCR.
13. Inkubujte zkumavku při 63 °C na PCR termocykleru po dobu 3 minut.
14. Umístěte nový sampPonechte zkumavku na magnetickém stojanu při pokojové teplotě po dobu 1 minuty nebo dokud není roztok čirý.
15. Zatímco je zkumavka na magnetickém stojanu, odsajte a zlikvidujte supernatant bez rušivých kuliček.
16. Vyjměte trubici z magnetického stojanu. Přidejte 120 µl promývacího roztoku do PCR zkumavky. Pipetujte, aby se kuličky znovu suspendovaly. V případě potřeby pulsujte, aby se roztok snížil.
17. Inkubujte zkumavku při 63 °C na PCR termocykleru po dobu 3 minut.
18. Umístěte sampPonechte zkumavku na magnetickém stojanu při pokojové teplotě po dobu 1 minuty nebo dokud není roztok čirý.
19. Zatímco je zkumavka na magnetickém stojanu, odsajte a zlikvidujte supernatant bez rušivých kuliček. K odstranění zbývajícího supernatantu použijte pipetu P20.
20. Vyjměte trubici z magnetického stojanu. Resuspendujte kuličky ve 20 µl promývacího roztoku.

POZNÁMKA
Toto je BOD BEZPEČNÉ ZASTAVENÍ. Promyté kuličky lze skladovat při teplotě 2 °C až 8 °C po dobu dvou týdnů.

Ampliify Knihovna

Spotřební materiál

• 2× PCR Master Mix (Kit Box 1, Růžový)
• 10× Primer I (Kit Box 1,  Bílý)
• 10× Primer II, T50# (Multiplex Primer Kit)
• Voda bez nukleázy (uživatel)
• 0.2 ml PCR zkumavka nebo stripová zkumavka (uživatel)

Příprava

1. Připravte si následující spotřební materiál:
   

   Položka	Skladování	Návod
   2× PCR Master Mix	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Švihněte trubicí 4 až 5  krát promíchat, poté krátce odstředit. Zůstaňte na ledě.
   10× primer I	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Vortexujte a promíchejte krátce odstředit. Zůstaňte na ledě.
   10× Primer II, T50#	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Vortexujte a promíchejte  krátce odstředit. Zůstaňte na ledě.
   Enhancer	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Vortexujte a promíchejte krátce odstředit. Uchovávejte při pokojové teplotě.
   Voda bez nukleázy	Pokojová teplota	Uchovávejte při pokojové teplotě.

2. Nastavit knihovnu AmpLifikační program (LAP) na termocykleru takto:
   • 63 °C 2 minuty
   • 72 °C 2 minuty
   • 98 °C 30 sekund
   • [98°C 15 sekund, 63°C 20 sekund, 72°C 30 sekund] x Číslo cyklu
   • 72 °C 3 minuty
   • 4°C navždy

POZNÁMKA:
Počet cyklů je flexibilní podle navazujících aplikací a požadavků. Doporučujeme začít s 13 cykly. Vyšší číslo cyklu vygeneruje více knihovny TELL-Seq jako vstup pro hybridizaci a zachycení, ale vyšší míru duplikace pro konečnou sekvenační analýzu. Nižší počet cyklů může snížit míru duplikace, ale nižší vstupy DNA mohou vést ke snížení účinnosti zachycení a snížení složitosti knihovny. Další úvahy při určování vhodného čísla cyklu naleznete na konci Knihovny kvalifikace a kvantifikace pro hybridizaci a zachycení.

Velikost genomu	Objem kuliček použitých (B) pro PCR	Objem PCR	Číslo cyklu
Velký	20 ml	75 ml	12-14

Postup

1. Perličky intenzivně vortexujte po dobu 10 sekund, aby se perličky znovu suspendovaly. Pulzní rotací snížíte roztok. Pomocí 20 µL špičky pipetujte kuličky nahoru a dolů 5krát, abyste se ujistili, že jsou všechny kuličky správně resuspendovány. Okamžitě přeneste celé množství roztoku perliček do nové zkumavky PCR.
2. Umístěte zkumavku PCR na magnetický stojan na 1 minutu nebo dokud není roztok čirý.
3. Zatímco je zkumavka na magnetickém stojanu, odstraňte 20 µl supernatantu bez rušivých kuliček. Vyjměte zkumavku PCR z magnetu.
4. Přidejte do zkumavky PCR následující činidla.
   

   Činidlo	Objem na reakci (µL)
   	Velký genom (75 µL)
   Voda bez nukleázy	16 ml
   2× PCR Master Mix	37.5 ml
   10× primer I	7.5 ml
   10× Primer II, T50#	7.5 ml
   Enhancer Zelený	4.5 ml

5. Dobře promíchejte vortexováním nebo pipetováním. Pulzní rotací snížíte roztok.
6. Umístěte zkumavku na termocykler a spusťte program LAP (viz výše) se správným počtem cyklů.
7. Po PCR amplifikaci, použijte 2 µl PCR produktu pro kontrolu kvality na Bioanalyzeru nebo TapeStation. Pokyny naleznete v části Kvalifikace a kvantifikace knihovny.

PRO TIP: Pokud kontrola kvality ukáže, že výtěžek knihovny je relativně nízký, vložte zkumavku se zbývajícím produktem PCR zpět do termocykleru a amppřed přechodem do sekce Vyčistit knihovnu proveďte další jeden nebo dva cykly navíc.

POZNÁMKA:
Toto je BOD BEZPEČNÉ ZASTAVENÍ. PCR produkt může být skladován při -25 °C až -15 °C po dobu jednoho měsíce.

Vyčistit knihovnu

Spotřební materiál

• AMPure XP (uživatel)
• Ethanol 200 proof (absolutní) pro molekulární biologii (uživatel)
• Voda bez nukleázy (uživatel)
• 0.2 ml PCR zkumavka nebo stripová zkumavka (uživatel)

Příprava

1. Připravte si následující spotřební materiál:

Položka	Skladování	Návod
Čerstvý 75% (v/v) ethanol	Pokojová teplota	Vyžaduje 400 ml za sekunduample. Smíchejte 1.5 ml ethanolu (200 proof) s 0.5 ml vody bez nukleázy. Promíchejte na vortexu a udržujte při pokojové teplotě.
AMPurčitě XP	2 °C až 8 °C	Před použitím jej přiveďte na pokojovou teplotu alespoň na 20 minut a důkladně promíchejte, aby se kuličky znovu suspendovaly.
Voda bez nukleázy	Pokojová teplota	Uchovávejte při pokojové teplotě.
TE pufr, pH 8.0	Pokojová teplota	Uchovávejte při pokojové teplotě.

Postup

1. Krátce centrifugujte sample PCR zkumavku, aby se veškerý roztok snížil.
2. Umístěte zkumavku na magnetický stojan na 1 minutu nebo dokud nebude roztok čirý.
3. Zatímco je zkumavka na magnetickém stojanu, přeneste supernatant do nové 0.2 ml zkumavky PCR bez rušivých kuliček.
4. Změřte objem přeneseného supernatantu (produkt PCR) pomocí pipety.
5. Přidejte následující činidla do produktu PCR do celkového objemu 100 µl.
   

   Činidlo	Objem na reakci
   PCR produkt	75 ml
   Voda bez nukleázy	Na konečných 100 ml celkem

6. Intenzivně vortexujte, aby se resuspendoval AMProztokem XP a přidejte 78 µl AMPure XP do 100 ul PCR produktu.
7. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů 10x.
8. Inkubujte při pokojové teplotě po dobu 5 minut.
9. Umístěte zkumavku na magnetický stojan na 1 minutu nebo dokud nebude roztok čirý.
10. Nasajte a zlikvidujte supernatant bez rušení AMPure korálky.
11. Zkumavku držte na magnetickém stojanu a přidejte do zkumavky 200 µl čerstvě připraveného 75% etanolu. Nechte 30 sekund sedět.
12. Nasajte a zlikvidujte supernatant bez rušivých kuliček.
13. Opakujte kroky 11-12 ještě jednou, přičemž trubici držte po celou dobu na magnetickém stojanu.
14. Ponechte zkumavku na magnetickém stojanu s otevřeným uzávěrem a nechte zkumavku 1-2 minuty schnout, aby se odpařily stopy etanolu. Korálky nepřesušujte.
15. Vyjměte zkumavku z magnetického stojanu a ke kuličkám přidejte 20 µl vody bez nukleázy.
16. Pro resuspendování kuliček napipetujte nebo vortexujte. Nechte 5 minut uležet.
17. Položte zkumavku na magnetický stojan na 1 minutu nebo dokud nebude roztok čirý.
18. Odeberte 18 µl supernatantu do nové zkumavky. Dávejte pozor, abyste korálky nenarušili.
19. Supernatant obsahuje knihovnu TELL-Seq™.

POZNÁMKA:
Toto je BOD BEZPEČNÉ ZASTAVENÍ. Vyčištěná knihovna TELL-Seq může být skladována při -25 °C až -15 °C po dobu jednoho měsíce.

Kvalifikujte a kvantifikujte knihovnu pro cílové obohacení

Spotřební materiál

• Agilent High Sensitivity DNA Kit nebo TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Test (uživatel)
• Qubit dsDNA HS Assay Kit (uživatel)
• TE pufr, pH 8.0 (uživatel)

POZNÁMKA:
Standardní kvantifikační test knihovny qPCR pro systém Illumina funguje pro knihovnu TELL-Seq, ale není vyžadován.

Příprava

1. Připravte si potřebný spotřební materiál, jak vyžaduje Bioanalyzer nebo TapeStation a Qubit.

Postup

1. Použijte 1 µl knihovny pro soupravu Agilent High Sensitivity DNA Kit nebo 2 µL knihovny pro test TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape.
2. Zkontrolujte uložený nevyčištěný produkt PCR z Ampsoučasně otevřete sekci Knihovna. Nevyčištěný produkt PCR může mít vysokou hladinu dimeru primeru a dimeru adaptéru. Před vložením na čip Bioanalyzer nebo pásku TapeStation vyžaduje dvojnásobné zředění vodou bez nukleázy, aby nedošlo k interferenci s nižším signálem markeru.
3. Knihovna dobré velikosti by měla mít většinu fragmentů knihovny pod 1000 bp (obrázek 1).Obrázek 1. Example of vyčištěná knihovna profile z testu TapeStation High Sensitivity D5000 Screen Tape.
4. Knihovnu lze skladovat při -25°C až -15°C.
5. Vytvořte 10krát zředěnou knihovnu TELL-Seq™ample: zřeďte 2 ul knihovny TELL-Seq™ 18 ul vody bez nukleázy. Použijte 4 µl naředěné knihovny ke kontrole koncentrace pomocí Qubit dsDNA HS Assay Kit.
6. Použijte koncentraci (ng/µL) a objem k výpočtu celkové hmotnosti každé knihovny TELL-Seq™ vstupující do procesu SureSelectXT HS Target Enrichment System. 500 ng -1,000 XNUMX ng knihovny TELL-Seq™ za sekunduample se doporučuje pro optimální výsledky, ale vstupy knihovny jsou nízké až na 250 ng za sampJsou možné, i když výkon může být negativně ovlivněn.
   POZNÁMKA:
   Pro protokol Hybridizace a zachycení existují omezení objemu. 12 µL je maximální povolený objem pro vstup DNA. Je třeba pečlivě zvážit, zda objem knihovny DNA spadá do tohoto rozsahu. V ideálním případě použijte veškerý dostupný materiál knihovny TELL-Seq po QC do hybridizační a zachycovací reakce.
7. (Volitelné) Knihovny TELL-Seq™ lze koncentrovat pomocí vakuového koncentrátoru SpeedVac. Pokud bude pro koncentrování knihovny použit SpeedVac, pak knihovna TELL-Seq™ AMPČištění ure XP lze z perliček XP eluovat alespoň 30 µl vody bez nukleázy pro lepší regeneraci. Po QC lze čistou knihovnu TELL-Seq™ koncentrovat na požadovaný objem pro hybridizaci a zachycení.

POZNÁMKA:
Pomocí vytvořených knihoven TELL-Seq™ lze použít další systémy Target Enrichment Systems jako IDT a Twist Biosciences. Postupujte podle specifikovaných protokolů Target Enrichment s použitím knihoven TELL-Seq™ jako vstupu DNA. Kromě podrobných blokátorů v každém protokolu použijte 5 ul TELL-Seq™ TargetSeq Blocker.

SureSelect Target Enrichment
Následující protokol je modifikací hybridizační a snímací části SureSelect XT HS Target Enrichment System pro Illumina Paired-End Multiplexed Sequencing Library Protocol (Agilent, G9702-90000). Úpravy umožňují kompatibilitu TELL-Seq™ WGS Library Prep se systémem Agilent SureSelect XT HS Target Enrichment System a všemi snímacími sondami Exon V8. Reagencie Agilent pouze pro hybridizaci a zachycení lze zakoupit samostatně ve formátu 16 reakcí (číslo dílu Agilent G9916B). Pokud používáte jiné systémy Target Enrichment Systems, postupujte podle specifikovaných protokolů pro každý systém a nahraďte knihovny TELL-Seq™ jako vstup DNA. Kromě podrobných blokátorů v každém protokolu Target Enrichment je také potřeba 5 ul blokátorů cíle TELL-Seq™

Hybridizujte knihovnu TELL-Seq™ s panelem Exome Capture Panel

Spotřební materiál

• SureSelect XT HS a XT Low Input Blocker Mix, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module, Box 2 (Post PCR), Modrý)
• SureSelect RNase Block, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 2 (Post PCR), Fialový)
• SureSelect Fast Hybridization Buffer, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 2 (Post PCR), Bottle)
• TELL-Seq™ Target Blocker (UST, TELL-Seq™ Target Blocker Box, Bílý)
• SSel XT HS a XT Low Input Human All Exon V7 (Agilent, SSel XT HS a XT Low Input Human All Exon V7, Červené)
• Voda bez nukleázy (uživatel)
• 0.2 ml PCR zkumavka nebo stripová zkumavka (uživatel)
• Knihovna TELL-Seq™ (uživatel)

Vstupní částka	Reaction Vol (ml)
500 -1,000 XNUMX ng	Až 12 ml

Příprava

1. Připravte si následující spotřební materiál:
   

   Položka	Skladování	Návod
   SureSelect XT HS a XT Low Input Blocker Mix	-25 °C až -15 °C	Roztát na ledu. Vortexujte pro promíchání a poté krátce odstřeďte. Zůstaňte na ledě.
   SureSelect RNase Block	-25 °C až -15 °C	Roztát na ledu. Promíchejte na vortexu a poté odstřeďte  krátce. Zůstaňte na ledě.
   SureSelect Fast Hybridization Buffer	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte a uchovávejte při pokojové teplotě
   TELL-Seq™ TargetSeq Blocker	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Vortexujte pro promíchání a poté krátce odstřeďte. Zůstaňte na ledě.
   TELL-Seq™ DNA knihovna	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte a uchovávejte u ledu

   SSel XT HS a XT Low Input Human All Exon V8

   -85 °C až -75 °C

   Roztát na ledu. Vortexujte pro promíchání a poté krátce odstřeďte. Zůstaňte na ledě.

2. Nastavte Hybridizační program (HP) na termocykleru (se zapnutým vyhřívaným víkem) s níže uvedeným programem. Spusťte program, poté ihned stiskněte tlačítko Pauza, čímž necháte vyhřívanou poklici dosáhnout teploty, zatímco budete nastavovat reakce.

Číslo segmentu	Počet cyklů	Teplota	Čas
1	1	95 °C	5 minut
2	1	65 °C	10 minut
3	1	65 °C	1 minuta
4	60	65 °C 37 °C	1 minuta 3 sekund
5	1	65 °C	Držet

Postup

1. Umístěte 500–1000 ng každé připravené knihovny TELL-Seq™ample do jamek proužkové zkumavky a poté doplňte konečný objem v každé jamce na 12 µl s použitím vody bez nukleázy, je-li to nutné. Ideálně udělat celkový ampDNA z knihovny TELL-Seq™ v rozsahu 500–1000 ng a vše použijte pro hybridizační reakci.
2. Ke každé knihovně TELL-Seq™ampdobře promíchejte, přidejte 5 µl SureSelect XT HS a XT Low Input Blocker Mix a přidejte 5 µl TELL-Seq™ Target Blocker. Jamky uzavřete a poté 5 sekund vortexujte vysokou rychlostí. Zkumavku s proužkem krátce otočte, aby se kapalina shromáždila a uvolnily se případné bubliny.
3. Přeneste zkumavky do termocykleru a stiskněte tlačítko Přehrát pro obnovení nastavení programu HP.
   POZNÁMKA:
   Termocykler musí být pozastaven během segmentu 3 (viz HP), aby bylo možné přidat další činidla do hybridizačních jamek, jak je popsáno v kroku 6. Během segmentů 1 a 2 programu tepelného cyklování začněte připravovat další činidla, jak je popsáno v části krok 4 a krok 5. V případě potřeby můžete tyto přípravné kroky dokončit po pozastavení termocykleru v Segmentu 3.
4. Připravte 25% roztok SureSelect RNase Block (obsahující 1 objem RNase Block se 3 objemy vody) podle tabulky níže. Připravte množství požadované pro počet hybridizačních reakcí v běhu plus přebytek.
   

   Činidlo

   Objem na reakci (ml)

   Objem pro 1 reakci		Objem pro 8 reakcí (včetně přebytku)	Objem pro 24 reakcí (včetně přebytku)
   SureSelect RNase Block	0.5 ml	4.5 ml	12.5 ml
   Voda bez nukleázy	1.5 ml	13.5 ml	37.5 ml

5. Připravte hybridizační mix knihovny Capture Library v následujícím pořadí.
   

   Činidlo	Objem na reakci (ml)
   	Objem pro 1 reakci	Objem pro 8 reakcí (včetně přebytku)	Objem pro 24 reakcí (včetně přebytku)
   25% roztok RNase Block	2 ml	18 ml	50 ml
   SSel XT HS a XT Low Input Human All Exon V7	5 ml	45 ml	125 ml
   SureSelect Fast Hybridization Buffer	6 ml	54 ml	150 ml

   Smíchejte uvedená činidla při pokojové teplotě. Dobře promíchejte vortexováním při vysoké rychlosti po dobu 5 sekund a poté krátce odstřeďte. Okamžitě pokračujte krokem 6.

6. Jakmile termocykler spustí Segment 3 HP (1 minuta při 65°C), stiskněte tlačítko Pauza. S cyklérem pozastaveným a při zachování DNA + Blocker sampv cykléru přeneste 13 µl hybridizačního mixu Capture Library Hybridization Mix z kroku 6 do každé sample dobře. Dobře promíchejte pipetováním nahoru a dolů pomalu 8 až 10krát. Hybridizační reakční jamky nyní obsahují přibližně 35 ul
7. Ujistěte se, že všechny jamky jsou zcela utěsněny. Krátce promíchejte na vortexu, poté krátce otáčejte stripovací zkumavkou, abyste odstranili všechny bubliny ze dna jamek. Okamžitě vraťte proužkovou trubici do termocykleru.
8. Stisknutím tlačítka Přehrát obnovíte program tepelného cyklování, abyste umožnili hybridizaci připravených DNAampsouborů do knihovny Capture Library.

Připravte magnetické kuličky potažené streptavidinem

Spotřební materiál

• Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (uživatel)
• SureSelect Binding Buffer (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 1 (Post PCR), CAP)

Příprava

Připravte si následující spotřební materiál:

Položka	Skladování	Návod
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	2 °C až 8 °C	Intenzivně centrifugujte. Uchovávejte při pokojové teplotě.
SureSelect Binding Buffer,	Pokojová teplota	Uchovávejte při pokojové teplotě.

Postup

1. Intenzivně resuspendujte magnetické kuličky Dynabeads MyOne Streptavidin T1 na vortexovém mixéru. Magnetické kuličky se během skladování usadí.
2. Pro každou hybridizaci sample, přidejte 50 µl resuspendovaných kuliček do jamek čerstvé PCR destičky nebo stripové zkumavky.
3. Promyjte kuličky přidáním 200 µl SureSelect Binding Buffer. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů 20krát nebo jamky uzavřete a vortexujte vysokou rychlostí po dobu 5–10 sekund.
4. Vložte destičku nebo proužkovou trubici do magnetického separátoru.
5. Počkejte alespoň 5 minut nebo dokud nebude roztok čirý, poté odstraňte a zlikvidujte supernatant.
6. Opakujte kroky 3-5 ještě dvakrát, celkem 3 mytí.
7. Resuspendujte kuličky ve 200 µl SureSelect Binding Buffer.

Zachyťte hybridizovanou DNA pomocí perliček potažených streptavidinem

Spotřební materiál

• SureSelect Wash Buffer 1, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 1 (Post PCR), )
• SureSelect Wash Buffer 2, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 1 (Post PCR), )

Příprava

Připravte si následující spotřební materiál:

Položka	Skladování	Návod
SureSelect Wash Buffer 1,	Pokojová teplota	Uchovávejte při pokojové teplotě.
SureSelect Wash Buffer 2,	Pokojová teplota	Zahřejte 200 ul alikvoty na 70 °C. Viz krok 4

Postup

1. Poté, co je hybridizační krok dokončen a tepelný cyklér dosáhne kroku udržení 65 °C, přeneste sampméně na pokojovou teplotu.
2. Okamžitě přeneste celý objem (přibližně 30 µl) každé hybridizační směsi do jamek obsahujících 200 µl promytých streptavidinových kuliček pomocí vícekanálové pipety. Pipetou nahoru a dolů 5–8krát promíchejte.
3. Inkubujte zkumavku se záchytnými proužky na 96jamkovém deskovém mixéru za intenzivního míchání (při 1400–1800 ot./min.) nebo na rotátoru po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Ujistěte se, že samplesy se v jamkách řádně promíchávají.
4. Ihned po inkubaci pokračujte dalším krokem. Během 30minutové inkubace pro zachycení předehřejte SureSelect Wash Buffer 2 na 70 °C, jak je popsáno níže. Umístěte 200 µl alikvoty promývacího pufru 2 do jamek čerstvé 96jamkové destičky nebo zkumavek se stripy. Pro každou DNA alikvotujte 6 jamek pufruample v běhu. Jamky uzavřete a poté inkubujte v termocykléru se zapnutým vyhřívaným víkem, udržujte jej při 70 °C, dokud se nepoužije v
5. Po dokončení 30minutové inkubační doby zahájené v kroku 3 odtočte sampkrátce, aby se shromáždila kapalina.
6. Umístěte zkumavku s proužkem do magnetického separátoru, abyste shromáždili kuličky. Počkejte, dokud nebude roztok čirý, poté odstraňte a zlikvidujte supernatant.
7. Resuspendujte kuličky ve 200 µl promývacího pufru SureSelect 1. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů 15–20krát, dokud se kuličky zcela nerozsuspendují.
8. Umístěte hadičku s proužkem do magnetického separátoru. Počkejte, až se roztok vyčeří (přibližně 1 minutu), poté odstraňte a zlikvidujte supernatant.
9. Vyjměte zkumavky s stripy z magnetického separátoru a přeneste je do stojanu při pokojové teplotě. Resuspendujte kuličky ve 200 µl promývacího pufru 70 předehřátého na 2°C. Pipetujte 15–20krát nahoru a dolů, dokud se kuličky zcela nerozsuspendují. Jamky uzavřete novými víčky a poté 8 sekund vortexujte vysokou rychlostí. Krátce otočte destičkou nebo stripovací zkumavkou, aby se shromáždila kapalina bez peletizace kuliček.
10. Inkubujte samppo dobu 5 minut při 70 °C na termocykléru s nasazeným vyhřívaným víkem.
11. Umístěte zkumavku s proužkem do magnetického separátoru při pokojové teplotě. Počkejte 1 minutu, než se roztok vyčeří, poté odstraňte a zlikvidujte supernatant.
12. Opakujte kroky 9-11 ještě pětkrát, celkem 6 mytí.
13. Po ověření, že byl odstraněn veškerý promývací pufr, přidejte 25 µl vody bez nukleázy do každé sample dobře. Pipetujte 8krát nahoru a dolů, aby se kuličky znovu suspendovaly. Sampmohou být předtím skladovány na ledu ampzvedání

Ampliify Captured Library

Spotřební materiál

• 5× Herculase II Reaction Buffer (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Clear)
• Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Red)
• 100 mM dNTP Mix, (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Green)
• SureSelect Post-Capture Primer Mix (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Clear)

Příprava

1. Připravte si následující spotřební materiál:
   

   Položka	Skladování	Návod
   5× Herculase II Reaction Buffer	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Vortexujte do promíchejte a poté krátce odstřeďte. Zůstaňte na ledě.
   Herculase II Fusion DNA polymerase	-25 °C až -15 °C	Krátce centrifugujte. Zůstaňte na ledě.
   Směs 100 mM dNTP	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Vortexujte do  promíchejte a poté krátce odstřeďte. Zůstaňte na ledě.
   SureSelect Post-Capture Primer Mix	-25 °C až -15 °C	Rozmrazte při pokojové teplotě. Vortexujte pro promíchání a poté krátce odstřeďte. Zůstaňte na ledě.

2. Na termocykleru nastavte následující program takto:
   • 98 °C 2 minuty
   • [98 °C 30 sekund, 63 °C 30 sekund, 72 °C 1 minuta] x 9
   • 72 °C 5 minuty
   • 4°C navždy

Postup

1. Připravte příslušný objem reakční směsi pro PCR. Přidejte do PCR zkumavky následující reagencie podle počtu reakcí.
   

   Činidlo	Objem na reakci (µL)
   	Objem pro 1 reakci	Objem pro 8 reakcí (včetně přebytku)	Objem pro 24 reakcí (včetně přebytku)
   Voda bez nukleázy	12.5 ul	112.5 ul	312.5 ul
   5× Herculase II Reaction Buffer	10 ul	90 ul	250 ul
   Herculase II Fusion DNA polymerase	1 ul	9 ul	25 ul
   Směs 100 mM dNTP	0.5 ul	4.5 ul	12.5 ul
   SureSelect Post-Capture Primer Mix	1 ul	9 ul	25 ul

2. Připravte příslušný objem reakční směsi pro PCR. Přidejte do PCR zkumavky následující reagencie podle počtu reakcí. Přidejte 25 µl reakční směsi PCR připravené v tabulce 29 do každé sampdo jamky obsahující 25 µl na kuličky navázané cílově obohacené DNA (připravené na straně 26 a uchovávané na ledu).
3. PCR reakce dobře promíchejte pipetováním nahoru a dolů, dokud není suspenze perliček homogenní. Vyvarujte se stříkání samples na stěny studny; netočte sampv tomto kroku.
4. Umístěte zkumavku na termocykler a spusťte program (viz výše) se správným počtem cyklů.
5. Když PCR amplifikační program je dokončen, krátce otočte zkumavku s stripem. Odstraňte kuličky potažené streptavidinem umístěním destičky nebo zkumavky s proužkem na magnetický stojan při pokojové teplotě. Počkejte 2 minuty, než se roztok vyčeří, poté odeberte každý supernatant (přibližně 50 µl) do jamek zkumavky se stripy.

Vyčistit zachycenou knihovnu 

Spotřební materiál

• AMPure XP (uživatel)
• Ethanol 200 proof (absolutní) pro molekulární biologii (uživatel)
• Voda bez nukleázy (uživatel)
• TE pufr, pH 8.0 (uživatel)
• 0.2 ml PCR zkumavka nebo stripová zkumavka (uživatel)

Příprava

Připravte si následující spotřební materiál:

Položka	Skladování	Návod
Čerstvý 75% (v/v) ethanol	Pokojová teplota	Vyžaduje 400 ml za sekunduample. Smíchejte 1.5 ml ethanolu (200 proof) s 0.5 ml vody bez nukleázy. Promíchejte na vortexu a udržujte při pokojové teplotě.
AMPurčitě XP	2 °C až 8 °C	Před použitím jej přiveďte na pokojovou teplotu alespoň na 20 minut a důkladně promíchejte, aby se kuličky znovu suspendovaly.
Voda bez nukleázy	Pokojová teplota	Uchovávejte při pokojové teplotě.
TE pufr, pH 8.0	Pokojová teplota	Uchovávejte při pokojové teplotě.

Postup

1. Roztok spusťte rychlým ~1 sekundovým odstředěním v centrifuze.
2. Intenzivně vortexujte, aby se resuspendoval AMProztokem XP a přidejte 50 µl AMPure XP do každého produktu PCR.
3. Promíchejte pipetováním nahoru a dolů 10x.
4. Inkubujte při pokojové teplotě po dobu 5 minut.
5. Umístěte zkumavku na magnetický stojan na 1 minutu nebo dokud nebude roztok čirý.
6. Nasajte a zlikvidujte supernatant bez rušení AMPure korálky.
7. Zkumavku držte na magnetickém stojanu a přidejte do zkumavky 200 µl čerstvě připraveného 75% etanolu. Nechte 30 sekund sedět.
8. Nasajte a zlikvidujte supernatant bez rušivých kuliček.
9. Opakujte kroky 7-8 ještě jednou, přičemž trubici držte po celou dobu na magnetickém stojanu.
10. Nechte zkumavku na magnetickém stojanu s otevřeným uzávěrem a nechte zkumavku 1-2 minuty schnout, aby se odpařily stopy etanolu. Korálky nepřesušujte.
11. Vyjměte zkumavku z magnetického stojanu a ke kuličkám přidejte 25 µl pufru TE.
12. Pro resuspendování kuliček napipetujte nebo vortexujte. Nechte 5 minut uležet.
13. Umístěte zkumavku na magnetický stojan na 1 minutu nebo dokud nebude roztok čirý.
14. Odeberte 23 µl supernatantu do nové zkumavky. Dávejte pozor, abyste korálky nenarušili.
15. Supernatant obsahuje zachycenou knihovnu TELL-Seq™.

POZNÁMKA:
Toto je BOD BEZPEČNÉ ZASTAVENÍ. Zachycená knihovna TELL-Seq může být skladována při -25 °C až -15 °C po dobu šesti měsíců.

Kvalifikujte a kvantifikujte zachycenou knihovnu pro sekvenování

Spotřební materiál

• Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit nebo TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assape (uživatel)
• Qubit dsDNA HS Assay Kit (uživatel)
• TE pufr, pH 8.0 (uživatel)

Příprava

1. Připravte si potřebný spotřební materiál, jak vyžaduje Bioanalyzer nebo TapeStation a Qubit.

Postup

1. Použijte 1 µl knihovny pro soupravu Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit nebo 2 µL knihovny pro test TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape.
2. Chcete-li určit koncentraci knihovny, nastavte oblast na softwaru pro analýzu Bioanalyzer nebo TapeStation od 150 bp do 1000 bp. Record sample Koncentrace (nM) pro tuto oblast (viz obrázek 2). Chcete-li určit velikost knihovny, nastavte Oblast od 150 bp do 3000 bp. Record sample Průměrná velikost (bp) jako velikost knihovny.
   POZOR
   Odečtená koncentrace z bioanalyzátoru (nebo TapeStation) by měla být použita jako výchozí bod k provedení nezbytného ředění nebo sloučení knihoven pro sekvenování. Ověřte koncentraci konečné zředěné sekvenační knihovny nebo poolu knihoven pomocí soupravy Qubit dsDNA HS Assay kit (viz krok 6).Obrázek 2. Example of exom capture library profile z testu Tape Station High Sensitivity D5000 Screen Tape.
3. Knihovna může být sekvenována okamžitě nebo uložena při -25 °C až -15 °C.
4. Při sekvenování nařeďte knihovnu pomocí TE pufru na koncentraci doporučenou každým sekvenačním systémem Illumina®. Pokud bude ve stejném běhu sekvenováno více než jedna knihovna, vytvořte fond zředěných knihoven pro sekvenování.
5. Změřte koncentraci knihovny pomocí Qubit dsDNA HS Assay Kit. Použijte hodnotu průměrné velikosti z měření Bioanalyzer (nebo TapeStation) jako velikost knihovny pro převod hmotnostní koncentrace na molární koncentraci (nM).

A = hmotnostní koncentrace (ng/µL)
S = velikost knihovny (bp)
Molární koncentrace (nM) = (A*1,000,000 650 XNUMX)/(S*XNUMX)
Pokud se koncentrace knihovny měřená pomocí Qubit liší od doporučené koncentrace o více než 10 %, upravte objem potřebný pro přípravu sekvenování.

Dokumenty / zdroje

UNIVERZÁLNÍ SEKVENOVÁNÍ TELL-Seq Target Enrichment [pdfUživatelská příručka TELL-Seq Target Enrichment, TELL-Seq, Target Enrichment, Enrichment

Reference

• Uživatelská příručka