UNIVERZÁLNÍ SEKVENOVÁNÍ 100018-USG TELL Seq Library Sequencing

Uživatelská příručka pro sekvenování knihovny TELL-Seq™
Pro všechny sekvenční systémy Illumina kromě iSeq 100

Pouze pro výzkumné účely. Nepoužívat v diagnostických postupech.
Dokument č. 100018 v8.0
února 2025

Tento dokument je majetkem společnosti Universal Sequencing Technology Corporation a je určen výhradně pro použití jejím zákazníkem ve spojení s použitím zde popsaných produktů a pro žádné jiné účely.
Pokyny v tomto dokumentu musí přesně dodržovat řádně vyškolený personál, aby bylo zajištěno správné a bezpečné použití soupravy TELL-Seq™.

UNIVERZÁLNÍ SEKVENČNÍ TECHNOLOGIE NEPŘEBÍRÁ ŽÁDNOU ODPOVĚDNOST, KTERÁ VZNIKNE PO NESPRÁVNÉM POUŽITÍ SOUPRAVY TELL-SEQ™ KIT.
©2022 Universal Sequencing Technology Corporation. Všechna práva vyhrazena. TELL-Seq™ je ochranná známka společnosti Universal Sequencing Technology Corporation. Všechny ostatní názvy, loga a další ochranné známky jsou majetkem příslušných vlastníků.

Zavedení

Tento protokol vysvětluje, jak spustit libovolné indexované knihovny TELL-Seq™ s párovými konci na sekvenčním systému Illumina®. Knihovna TELL-Seq™† vyžaduje vlastní sekvenční primery pro libovolné sekvenční systémy Illumina a obsahuje 18bázovou sekvenci s indexem 1 používanou jako molekulární čárový kód pro propojené čtení, která musí být kompletně sekvenována.

 Obsah sady

Sada TELL-Seq™ Illumina® Sequencing Primer Kit (PN 100004)

Sada TELL-Seq™ Illumina® Sequencing Primer Kit, HT (PN 100013) 

Struktura knihovny a schéma sekvenování TELL-Seq™

 

Index 1 (tj. index I7) obsahuje sekvence TELL Bead o 18 bázích, které MUSÍ být kompletně sekvenovány. Index 2 (tj. index I5) obsahuje 8 bází (řada T) nebo 10 bází (řada C) sample indexové primerové sekvence používané v knihovně amplifikace. Výhodné je sekvenování párového konce. Minimální požadovaná délka čtení je 2×96; Maximální požadovaná délka čtení je 2×150.

Example of Illumina® Sequencing % Base by Cycle Chart

Pokyny pro sekvenování Illumina®

1. Nařeďte knihovnu TELL-Seq™ podle koncentrace a objemu specifické pro sekvenační platformu Illumina®.
2. Knihovny mohou být spojeny dohromady pro sekvenování, když jsou v knihovně použity různé multiplexní primery ampkrok liifikace.
3. K sekvenování knihoven TELL-Seq™ jsou vyžadovány vlastní sekvenační primery, které jsou součástí sady TELL-Seq™ Illumina Sequencing Primer Kit.
4. Tyto vlastní sekvenační primery lze vložit do specifikovaných jamek pro vlastní primery. Alternativně mohou být také vloženy do odpovídajících standardních jamek sekvenačního primeru Illumina®, když je kontrolní knihovna Illumina® PhiX obohacena v sekvenačním běhu.
5. Custom Index 2 primer je potřeba pouze tehdy, když je pro sekvenování spojeno více knihoven TELL-Seq™ s různými multiplexními primery a když sekvenátor vyžaduje i5 index sekvenační primer. V současnosti pouze pro MiSeq, vlastní Index 2 Primer není vyžadován. Také pro nepodporované systémy, jako jsou činidla HiSeq 2000/2500 a NovaSeq v1, není vlastní primer Index 2 vyžadován.
6. Minimální počet sekvenčních běhů lze provést s použitím množství poskytnutých sekvenačních primerů se mění v závislosti na sekvenačním systému.

Sekvenční systém	Je vyžadován vlastní Index 2 Primer?
NovaSeq X/X Plus	Ano
NovaSeq 6000	Ano
HiSeq 3000/4000	Ano
DalšíSeq	Ano
MiSeq	Žádný
MiniSeq	Ano

 ExampTHEample List pro systém MiSeq

Níže je exampsamplist pro běh 2×146 PE s 18cyklovým indexem 1 (tj. index I7) a 8cyklovým nebo 10bázovým (C-series) indexem 2 (tj. indexem I5) sekvenováním pomocí vlastních sekvenačních primerů pro čtení 1 , Index 1 a Read 2, které budou vloženy do jamek vlastního sekvenačního primeru. Protože MiSeq používá primer P5 na povrchu průtokové cely jako sekvenační primer pro čtení Indexu 2, není pro systém MiSeq vyžadován vlastní primer TELL-Seq™ s indexem 2. Demultiplexování všech sdružených knihoven bude založeno na sample index (tj. index 2). Po dokončení sekvenování bude zpracována analytickým potrubím TELL-read samostatně.

 

Doporučení délky čtení sekvencí Illumina®

1. Doporučuje se sekvenování párového konce.
2. Knihovna TELL-Seq™ Index 1 má 18 bází, Index 2 je 8 bází (řada T) nebo 10 bází (řada C). U obou indexů je celkem 26 bází (řada T) nebo 28 bází (řada C) ve srovnání s celkovým počtem 16 bází standardního duálního indexu Illumina.
3. Dalších 10 cyklů potřebných pro sekvenování indexu knihovny TELL-Seq™ je třeba odečíst od čtení 1 a 2 cyklů sekvenování rovnoměrně. Protože sekvenační činidlo Illumina zaručuje 2 cykly navíc, je třeba odečíst 4 cykly pro čtení 1 a 4 cykly pro čtení 2.
4. Doporučená délka sekvenování je 2×96 PE až 2×146 PE pro běh s duálním indexem; 2×100 PE až 2×150 PE za jednu sekunduampspustit bez nutnosti čtení indexu 2.

Zvažování hloubky sekvenování

1. Pro dostatečné pokrytí TELL Bead je vyžadována odpovídající hloubka sekvenování. Čím více korálků TELL se používá v knihovně ampPokud chcete vygenerovat knihovnu TELL-Seq™, tím více čtení sekvencí bude zapotřebí k získání požadované hloubky sekvenování. Čím méně TELL Beads se však používá pro knihovnu amplifikací, tím nižší bude složitost knihovny, což může vést k vyšší míře duplikace čtení sekvencí. Rovnováha mezi použitými kuličkami TELL Beads a požadovanou složitostí knihovny TELL-Seq™ může záviset na velikosti genomu a aplikaci.
2. Pro aplikaci de novo sestavení, alespoň 60x pokrytí genomu sample se doporučuje obecně. V závislosti na množství TELL Beads použitých pro knihovnu však může stačit i nižší sekvenační pokrytí amplifikace a složitost knihovny TELL-Seq™.
3. Pro fázování člověkem alespoň 500 milionů čtení clusteru za sekunduample, což je ~40x hloubka je doporučena.
4. Pro cílené sekvenování se doporučuje minimálně 100násobné pokrytí.

Knihovna Multiplexní sekvence indexu primeru (tj. čtení indexu 2): řada T (8 bází)

Základní nátěr Library Multiplex (řada T)	Pro Sample List MiSeq	Pro Sample List NovaSeq, NovaSeq X, NextSeq, MiniSeq
T501	TGAACCTT	AAGGTTCA
T502	TGCTAAGT	AKTTAGCA
T503	TGTTCTCT	AGAGAACA
T504	TAAGACAC	GTGTCTTA
T505	CTAATCGA	TCGATTAG
T506	CTAGAACA	TGTTCTAG
T507	TAAGTTCC	GGAACTTA
T508	TAGACCTA	TAGVOP
T509	CATCCGAA	TTCGGATG
T510	TTATGAGT	ACTCATAA
T511	AGAGGCGC	GCGCCTCT
T512	TAGCCGCG	CGCGGCTA
T513	ACGAATAA	TTATTCGT
T514	TTCGTAGG	CCTACGAA
T515	GATCTGCT	AGCAGATC
T516	CGCTCCGC	GCGGAGCG
T517	AGGCTATA	TATAGCCT
T518	GCCCTTAT	ATAGAGGC
T519	AGGATAGG	CCTATCCT
T520	TCAGAGCC	GGCTCTGA
T521	CTTCGCCT	AGGCGAAG
T522	TAAGATTA	TAATCTTA
T523	AGTAAGTA	TAKTAKT
T524	GACTTCCT	AGGAAGTC

 Knihovna Multiplexní sekvence indexu primeru (tj. čtení indexu 2): C,D,E,F-series (10-base)

Library Multiplex Primer (série C)	Pro Sample List MiSeq	Pro Sample List NovaSeq, NovaSeq X, NextSeq, MiniSeq
C501	ACGTACGTAC	GTACGTACGT
C502	CATGCATGCA	TGCATGCATG
C503	GTACGTACGT	ACGTACGTAC
C504	TGCATGCATG	CATGCATGCA
C505	ATGCTGATCA	TGATCAGCAT
C506	CACAGCTGTG	CACAGCTGTG
C507	GCTGATCAGC	GCTGATCAGC
C508	TGATCAGCAT	ATGCTGATCA
C509	ATTCAATACT	AGTATTGAAT
C510	CTAGCGCTAG	CTAGCGCTAG
C511	GCTAGTAGTA	TACTACTAGC
C512	TCCAATCAAG	CTTGATTGGA
C513	AATATTGCTG	CAGCAATATT
C514	CGTCGTTACG	CGTAACGACG
C515	GATTGATTCC	GGAATCAATC
C516	TCTAACAATG	CATTGTTAGA
C517	AGAATTGTCA	TGACAATTCT
C518	CTCAGCAATT	AATTGCTGAG
C519	GGTCCTTGTC	GACAAGGACC
C520	AGGCCTGACA	TGTCAGGCCT
C521	CTCCTAGTGG	CCACTAGGAG
C522	GGTTACAGCT	AGCTGTAACC
C523	CTGATTGGCG	CGCCAATCAG

C524	ATTGGTTAGA	TCTAACCAAT
C525	CCATTCAACT	AGTTGAATGG
C526	CAGTATTGAC	GTCAATACTG
C527	GAGTCCTCAA	TTGAGGACTC
C528	AGCTACTACT	AGTAGTAGCT
C529	TAGCTAGCGC	GCGCTAGCTA
C530	GATGCAACAC	GTGTTGCATC
C531	CCTCAGTACA	TGTACTGAGG
C532	CGGTAATTCA	TGAATTACCG
C533	CGCAATGGCT	AGCCATTGCG
C534	GTACGTTGAA	TTCAACGTAC
C535	TTGATCAGTA	TACTGATCAA
C536	GGCCTAACAA	TTGTTAGGCC
C537	GTTGTTGGAA	TTCCAACAAC
C538	TACGTTGGAC	GTCCAACGTA
C539	ACACCATGCA	TGCATGGTGT
C540	GCAATAGTAC	GTACTATTGC
C541	ACGCAGCCAG	CTGGCTGCGT
C542	CGAGTTGACG	CGTCAACTCG
C543	CGTGGCTGAA	TTCAGCCACG
C544	TCTCAAGGAC	GTCCTTGAGA
C545	CCTAGGCACT	AGTGCCTAGG
C546	CTGCGGTAAT	ATTACCGCAG
C547	GGCACTACCA	TGGTAGTGCC
C548	GCTCAATCAA	TTGATTGAGC
C549	AGGCACACAC	GTGTGTGCCT
C550	CCTGGCAAGA	TCTTGCCAGG

C551	TAATTGGTAG	CTACCAATTA
C552	GCCAACAAGT	ACTTGTTGGC
C553	ATGGCTTATA	TATAAGCCAT
C554	GCATGGCCTT	AAGGCCATGC
C555	ACAATACTGG	CCAGTATTGT
C556	GGATTGGACT	AGTCCAATCC
C557	ACTGTACTAT	ATAGTACAGT
C558	CAGCTGTGAG	CTCACAGCTG
C559	CTTGAGGACC	GGTCCTCAAG
C560	GGTACAATAG	CTATTGTACC
C561	CTGACTACTA	TAGTAGTCAG
C562	TCAACCATGG	CCATGGTTGA
C563	ATTATAACCG	CGGTTATAAT
C564	ACTAGTCCTT	AAGGACTAGT
C565	ACTTGGACGT	ACGTCCAAGT
C566	ATGGTTAGGA	TCCTAACCAT
C567	ATGGTACCAA	TTGGTACCAT
C568	GAATTGACTC	GAGTCAATTC
C569	AGCAACCAGG	CCTGGTTGCT
C570	TACTGTGCTG	CAGCACAGTA
C571	CAACAACGTC	GACGTTGTTG
C572	CAGTAGCGCT	AGCGCTACTG
C573	ATTACCAATC	GATTGGTAAT
C574	TAAGGACCGC	GCGGTCCTTA
C575	ACACGTACCG	CGGTACGTGT
C576	CAACGTTGTT	AACAACGTTG
C577	ATTGTGCTGA	TCAGCACAAT

C578	GTACCAACAG	CTGTTGGTAC
C579	TTGTCAAGGA	TCCTTGACAA
C580	CTTGTACGTA	TACGTACAAG
C581	TGCCCTGTAA	TTACAAGGCA
C582	TAGTAGCTTA	TAAGCTACTA
C583	GACCGCAATG	CATTGCGGTC
C584	CTACTAGCTT	AAGCTAGTAG
C585	AGCACACGTT	AACGTGTGCT
C586	TGTTATAAGC	GCTTATAACA
C587	GTTGCCAAGT	ACTTGGCAAC
C588	CTGGCAACCG	CGGTTGCCAG
C589	TTAGGCCTTA	TAAGGCCTAA
C590	CGCAGCACAG	CTGTGCTGCG
C591	CTAGGCACAA	TTGTGCCTAG
C592	TGTTGTACAG	CTGTACAACA
C593	CTAACGTGGC	GCCACGTTAG
C594	GCGTACTGGT	ACCAGTACGC
C595	GGCCTGAATT	AATTCAGGCC
C596	CATGCTCGAG	CTCGAGCATG

Library Multiplex Primer (řada D)	Pro Sample List MiSeq	Pro Sample List NovaSeq, NovaSeq X, NextSeq, MiniSeq
D501	AGCACTGTAA	TTACAGTGCT
D502	CCGAAGTACT	AGTACTTCGG
D503	GTTACAAGTA	TACTTGTAAC
D504	TGATTGCGTG	CACGCAATCA
D505	ATCTTAGGCA	TGCCTAAGAT

D506	CACGCAAGTT	AACTTGCGTG
D507	GAGCTTAGGA	TCCTAAGCTC
D508	TATTGCTCGA	TCGAGCAATA
D509	AACATCTGAG	CTCAGATGTT
D510	CAACTCAGCA	TGCTGAGTTG
D511	GAACTATATG	CATATAGTTC
D512	TAATAGTCTA	TAGACTATTA
D513	AAGATTGACG	CGTCAATCTT
D514	CACGTAGCCG	CGGCTACGTG
D515	GACTCGATCA	TGATCGAGTC
D516	TAATCCTCGC	GCGAGGATTA
D517	AAGCTCCTGG	CCAGGAGCTT
D518	CAGATTGTTG	CAACAATCTG
D519	GATGCTATTC	GAATAGCATC
D520	TAATCCTCGC	GCGAGGATTA
D521	AAGTATACCT	AGGTATACTT
D522	CAGTAGCCAA	TTGGCTACTG
D523	GCAAGGACTC	GAGTCCTTGC
D524	TACTACTGTA	TACAGTAGTA
D525	AATCCTAGCT	AGCTAGGATT
D526	CATTGGCAAG	CTTGCCAATG
D527	GCCTGAGAAT	ATTCTCAGGC
D528	TACTAGCAAG	CTTGCTAGTA
D529	ACAGCTAGTC	GACTAGCTGT
D530	CCAACCAGTA	TACTGGTTGG
D531	GCGCTCAATT	AATTGAGCGC
D532	TAGCGCGGAC	GTCCGCGCTA

D533	ACCTATAGTT	AACTATAGGT
D534	CCACGTCAGG	CCTGACGTGG
D535	GCTACGCAAT	ATTGCGTAGC
D536	TAGTTGCTGC	GCAGCAACTA
D537	ACGGTACAAC	GTTGTACCGT
D538	CCGAACTTCG	CGAAGTTCGG
D539	GCTCCTAATT	AATTAGGAGC
D540	TATCCTCGAT	ATCGAGGATA
D541	ACTCGATTCT	AGAATCGAGT
D542	CCTGGTAATT	AATTACCAGG
D543	GCTTAGTTGG	CCAACTAAGC
D544	TCAGCAAGGA	TCCTTGCTGA
D545	ACTGGTAGCA	TGCTACCAGT
D546	CGATCAACCT	AGGTTGATCG
D547	GGAAGTAGCA	TGCTACTTCC
D548	TCAGCTGCGG	CCGCAGCTGA
D549	ACTGGTAGCA	TGCTACCAGT
D550	CGATCAACCT	AGGTTGATCG
D551	GGCAAGATGA	TCATCTTGCC
D552	TCCGCCAATG	CATTGGCGGA
D553	AGAATCTTAT	ATAAGATTCT
D554	CGCTAGCAAC	GTTGCTAGCG
D555	GGCCTTATAT	ATATAAGGCC
D556	TCGAATACTA	TAGTATTCGA
D557	AGCAATGGTA	TACCATTGCT
D558	CGGTCTGATC	GATCAGACCG
D559	GGTCCGCCAT	ATGGCGGACC

D560	TCGAATACTA	TAGTATTCGA
D561	AGCACTGTAA	TTACAGTGCT
D562	CGTACTACCG	CGGTAGTACG
D563	GGTTCATCGG	CCGATGAACC
D564	TCGGAGCTGC	GCAGCTCCGA
D565	AGGACGTTAG	CTAACGTCCT
D566	CGTTGACAAT	ATTGTCAACG
D567	GTACTGACAC	GTGTCAGTAC
D568	TCTAAGATAG	CTATCTTAGA
D569	AGTGCTCAAC	GTTGAGCACT
D570	CTAAGAACCT	AGGTTCTTAG
D571	GTATAATTAC	GTAATTATAC
D572	TGATTGCGTG	CACGCAATCA
D573	ATATTCGACG	CGTCGAATAT
D574	CTATAACGAC	GTCGTTATAG
D575	GTCGTTAGGT	ACCTAACGAC
D576	TGCCACTGAT	ATCAGTGGCA
D577	ATCGGCTAAG	CTTAGCCGAT
D578	CTCAAGTTGC	GCAACTTGAG
D579	GTGTGTTCGA	TCGAACACAC
D580	TGCTATAGTC	GACTATAGCA
D581	ATGAGCTATT	AATAGCTCAT
D582	CTCACAACGA	TCGTTGTGAG
D583	TGCTCGATTG	CAATCGAGCA
D584	ATGTTGGACT	AGTCCAACAT
D585	CTGATGTTAG	CTAACATCAG
D586	TGGTAACCAG	CTGGTTACCA

D587	ATTCGAAGTA	TACTTCGAAT
D588	CTTAGCTCCT	AGGAGCTAAG
D589	TGTAATCGAT	ATCGATTACA
D590	CTTGGACTTC	GAAGTCCAAG
D591	TGTACTTGAA	TTCAAGTACA
D592	TTAAGCTCAG	CTGAGCTTAA
D593	TTACAACCAG	CTGGTTGTAA
D594	TTCTCAGCCA	TGGCTGAGAA
D595	TTGCATGGCT	AGCCATGCAA
D596	TTGGCGGTAC	GTACCGCCAA

Library Multiplex Primer (řada E)	Pro Sample List MiSeq	Pro Sample List NovaSeq, NovaSeq X, NextSeq, MiniSeq
E501	AGCCACGGTC	GACCGTGGCT
E502	CCGCCTGAGT	ACTCGGCGG
E503	GTATATACC	GGTATATAAC
E504	CTTCCTGGCA	TGCCAGGAAG
E505	ATCGAATTGC	GCAATTCGAT
E506	CACGTGTTGT	ACAACACGTG
E507	GAGCTGTGTT	AACACAGCTC
E508	TATTACAGAT	ATCTGTAATA
E509	AACAATGGCG	CGCCATTGTT
E510	CAACTCGCTA	TAGCGAGTTG
E511	GAATTGCTCA	TGAGCAATTC
E512	GTGTGTTCGA	TCGAACACAC
E513	CGATTCGAGC	GCTCGAATCG
E514	GTCAACGTTA	TAACGTTGAC

E515	GACAATCCTA	TAGGATTGTC
E516	TAATCAGACT	AGTCTGATTA
E517	AAGCTTATAT	ATATAAGCTT
E518	CATATTGTAA	TTACAATATG
E519	GATAGGACTT	AAGTCCTATC
E520	ATGCTAGGTT	AACCTAGKOČKA
E521	GCAAGATTAG	CTAATCTTGC
E522	CAGCTGTATA	TATACAGCTG
E523	GCAAGTCTAA	TTAGACTTGC
E524	TACTAGCAAG	CTTGCTAGTA
E525	AATACTGTTA	TAACAGTATT
E526	CATATCTGAC	GTCAGATATG
E527	GCCACTAAGG	CCTTAGTGGC
E528	CTGGCAATTC	GAATTGCCAG
E529	ACAATAGGCG	CGCCTATTGT
E530	CCATGCTAAG	CTTAGCATGG
E531	GCGAGCGATC	GATCGCTCGC
E532	TAGGTAGTTC	GAACTACCTA
E533	ACCTTGGACC	GGTCCAAGGT
E534	TGACTAATAC	GTATTAGTCA
E535	GCTATATCTG	CAGATATAGC
E536	TCTAGTTCAG	CTGAACTAGA
E537	ACGGTTGAGA	TCTCAACCGT
E538	CTGATTCCGG	CCGGAATCAG
E539	TGGTAACCAG	CTGGTTACCA
E540	GACTCAGACA	TGTCTGAGTC
E541	TTAGCCAATA	TATTGGCTAA

E542	CCTTAAGGCG	CGCCTTAAGG
E543	CGTAGCAATC	GATTGCTACG
E544	CATGGCTAAT	ATTAGCCATG
E545	ACTCGACAAT	ATTGTCGAGT
E546	CGAGTCTAGG	CCTAGACTCG
E547	GGACTCAGCT	AGCTGAGTCC
E548	TCAGCAAGGA	TCCTTGCTGA
E549	CGATTCCTTA	TAAGGAATCG
E550	ATTAGGCAAT	ATTGCCTAAT
E551	TTGTCGAAGG	CCTTCGACAA
E552	TCCAAGTAGC	GCTACTTGGA
E553	AGATAGTCCG	CGGACTATCT
E554	CGCTAACATA	TATGTTAGCG
E555	GGCTAATTGT	ACAATTAGCC
E556	AGGTACGTCA	TGACGTACCT
E557	TTCCAAGTTC	GAACTTGGAA
E558	CGGAGCTCCG	CGGAGCTCCG
E559	GGTACTAATA	TATTAGTACC
E560	TCGAAGGCAA	TTGCCCTTCGA
E561	CTCCTTGATG	CATCAAGGAG
E562	GCAATTCCGG	CCGGAATTGC
E563	ACTACGCAGC	GCTGCGTAGT
E564	AGGAATGGCC	GGCCATTCCT
E565	AGGTTAGKOČKA	ATGCTAACCT
E566	CGTCCTAGAC	VOPTAGGACG
E567	GCGTGGCAAT	ATTGCCACGC
E568	TCTGATCGAC	GTCGATCAGA

E569	AGTTGTCAGG	CCTGACAACT
E570	CTACGCCAAT	ATTGGCGTAG
E571	GTAGTTGCGT	ACGCAACTAC
E572	TGAGCGCTAT	ATAGCGCTCA
E573	ATACCTTAGT	ACTAAGGTAT
E574	GCACACCATT	AATGGTGTGC
E575	GTCTAAGGAG	CTCCTTAGAC
E576	CATTCCGCGG	CCGCGGAATG
E577	GCGTACCTAG	CTAGGTACGC
E578	CTCAATAGCA	TGCTATTGAG
E579	GTGCTAAGCC	GGCTTAGCAC
E580	TGCCACTATC	GATAGTGGCA
E581	GCTGTTGAAT	ATTCAACAGC
E582	CGGCTAATCC	GGATTAGCCG
E583	AACTACCGCA	TGCGGTAGTT
E584	ATGCATCAAG	CTTGATGCAT
E585	CTGACTTGCA	TGCAAGTCAG
E586	TGGTACCTAT	ATAGGTACCA
E587	ATTAGCTAAC	GTTAGCTAAT
E588	TGGTACCTAT	ATAGGTACCA
E589	TGTTGCTACC	GGTAGCAACA
E590	CTTATATAAG	CTTATATAAG
E591	TCAAGTCTGT	ACAGACTTGA
E592	TGAGCGCTAT	ATAGCGCTCA
E593	TTAGGCGTAC	GTACGCCTAA
E594	TTCTCATCAG	CTGATGAGAA
E595	CTAGGTATTG	CAATACCTAG

E596

TTGCTGACTA

TAGTCAGCAA

Library Multiplex Primer (řada F)	Pro Sample List MiSeq	Pro Sample List NovaSeq, NovaSeq X, Next Seq, MiniSeq
F501	AGCCAGTAGC	GCTACTGGCT
F502	CCGATGAGTT	AACTCATCGG
F503	GTTCAACTTC	GAAGTTGAAC
F504	TTGAGCATCA	TGATGCTCAA
F505	ATCAACAGTG	CACTGTTGAT
F506	CACACGGTAG	CTACCGTGTG
F507	GAGGATTGCT	AGCAATCCTC
F508	TATCTTGGCC	GGCCAAGATA
F509	AACTAGTGGC	GCCACTAGTT
F510	CAATCCTGGT	ACCAGGATTG
F511	GAAGGTTACG	CGTAACCTTC
F512	CTAAGAACCT	AGGTTCTTAG
F513	CACACGGTAG	CTACCGTGTG
F514	AATTAGTCTG	CAGACTAATT
F515	GACCGTGTTA	TAACACGGTC
F516	TAATTCGAGG	CCTCGAATTA
F517	AAGATTGACG	CGTCAATCTT
F518	CAACTCGCTA	TAGCGAGTTG
F519	GATTCGAACT	AGTTCGAATC
F520	GCCTTGAGTT	AACTCAAGGC
F521	CACAGATTAG	CTAATCTGTG
F522	CAGCTAGGCC	GGCCTAGCTG
F523	GCAAGGTATA	TATACCTTGC

F524	TACCTAGGTA	TACCTAGGTA
F525	AATCCTTGAA	TTCAAGGATT
F526	CATCGAACCT	AGGTTCGATG
F527	GCCTGCGTAA	TTACGCAGGC
F528	CATCGAACCT	AGGTTCGATG
F529	ACAGTGCCAT	ATGGCACTGT
F530	CCAACTATTG	CAATAGTTGG
F531	GCGTACCGCA	TGCGGTACGC
F532	TAGGAGCGAT	ATCGCTCCTA
F533	ACCAATTGGT	ACCAATTGGT
F534	AATACTGTTA	TAACAGTATT
F535	GCTGTTGAAT	ATTCAACAGC
F536	TTACAACCAG	CTGGTTGTAA
F537	ACGTCAAGTC	GACTTGACGT
F538	CAATTCAATG	CATTGAATTG
F539	TGAATTCAGC	GCTGAATTCA
F540	ACGTACAGCT	AGCTGTACGT
F541	TGACTACCAT	ATGGTAGTCA
F542	CCTGGTGTGA	TCACACCAGG
F543	GACTAATCGC	GCGATTAGTC
F544	ACGTTAGTGC	GCACTAACGT
F545	ACTCGATTCT	AGAATCGAGT
F546	CGACAAGATT	AATCTTGTCG
F547	GGAATTGGCT	AGCCAATTCC
F548	TCACAGCCGA	TCGGCTGTGA
F549	CTGTACTGTA	TACAGTACAG
F550	TCGCTCGAGG	CCTCGAGCGA

F551	ACCTTAGCAA	TTGCTAAGGT
F552	TCCGGACTAC	GTAGTCCGGA
F553	AGAACTTGCA	TGCAAGTTCT
F554	CGCAGGACTT	AAGTCCTGCG
F555	GGCAAGATGA	TCATCTTGCC
F556	GCCTAGCGCG	CGCGCTAGGC
F557	GACATCGCTA	TAGCGATGTC
F558	CGGCTAATCC	GGATTAGCCG
F559	GGTTGAGCTT	AAGCTCAACC
F560	TCGCTCAGGC	GCCTGAGCGA
F561	GCTGATTATA	TATAATCAGC
F562	GCGCTAGTCC	GGACTAGCGC
F563	TATGTCTGAA	TTCAGACATA
F564	AAGCTTATAT	ATATAAGCTT
F565	AGGAATGGCC	GGCCATTCCT
F566	CGTAGCGCGC	GCGCGCTACG
F567	GCCTGCGTAA	TTACGCAGGC
F568	TCTTAGCGAT	ATCGCTAAGA
F569	AGTTCTAAGA	TCTTAGAACT
F570	CTAGGTATTG	CAATACCTAG
F571	GTAGTACTAC	GTAGTACTAC
F572	TGACAAGTAG	CTACTTGTCA
F573	ATAGTCTGAG	CTCAGACTAT
F574	CTGTGTTACA	TGTAACACAG
F575	VOPTAGCCAC	GTGGCTAGAC
F576	AATCAAGGTT	AACCTTGATT
F577	KATAATTATG	KATAATTATG

F578	CTCGAGCTAT	ATAGCTCGAG
F579	GTGCCTGATG	CATCAGGCAC
F580	TGCTCGATTG	CAATCGAGCA
F581	GATTCGAACT	AGTTCGAATC
F582	TCGTTGAGGA	TCCTCAACGA
F583	AGCCAGGCGT	ACGCCTGGCT
F584	ATGTCAGATT	AATCTGACAT
F585	CTGTATATAC	GTATATACAG
F586	TGGTGTCAAC	GTTGACACCA
F587	ATTGCATGCT	AGCATGCAAT
F588	AGTATTCATA	TATGAATACT
F589	TGTAATTCCG	CGGAATTACA
F590	CTTCCTGGCA	TGCCAGGAAG
F591	TCCGCGCGGA	TCCGCGCGGA
F592	CACTGTTCGG	CCGAACAGTG
F593	TTAGCCAATA	TATTGGCTAA
F594	TTCGAGCTGA	TCAGCTCGAA
F595	GTACCGCGCG	CGCGCGGTAC
F596	TTGAGCATCA	TGATGCTCAA

Dodatek

Přidání vlastních primerů TELL-Seq™ do sekvenačních primerů Illumina®

Knihovny TELL-Seq™ vyžadují pro sekvenční platformy Illumina vlastní sekvenční primery. Přidání (nebo kombinování) vlastních sekvenčních primerů TELL-Seq™ Illumina do standardních sekvenčních primerů Illumina je nutné, pokud do sekvenčního běhu zahrnujete kontrolní knihovnu PhiX nebo jiné standardní knihovny Illumina s knihovnami TELL-Seq™. Poznámka: Čtení Index 1 TELL-Seq™ má 18 bází a vyžaduje 18cyklové sekvenování; čtení Index 2 má 8 bází pro primer řady T a 10 bází pro primer řady C. Postup pro přidání vlastních primerů do primerů Illumina

• Pozice kazety, celkové objemy a konečná koncentrace vlastních primerů pro každou platformu jsou uvedeny v tabulkách níže.
• Vypočítejte objem uživatelského primeru, který se má přidat k pozici kazety Illumina, na základě konečné koncentrace uživatelského primeru v kazetě.*
• Po přidání vlastního primeru upravte pipetu na polovinu celkového objemu a jemně pětkrát pipetujte nahoru a dolů, aby se důkladně promíchala.

U platforem MiSeq, MiniSeq, NextSeq a NovaSeq nezaškrtávejte pozici políčka „custom primer“ v samplist nebo během nastavení běhu. * Pro výpočet množství primeru, které je třeba přidat do jamky, použijte rovnici (C1)*(V1) = (C2)*(V2), kde:

• V1 = řešení pro objem vlastního základního nátěru, který má být přidán
• C2 = doporučená konečná koncentrace základního nátěru z níže uvedené tabulky
• V2 = celkový objem primeru Illumina v níže uvedených tabulkách

Example pro platformu MiSeq:
100M * V1 = 0.5M * 680L V1 = 3.4 µl

Důležitá poznámka: Níže uvedené pokyny jsou založeny na aktuálních objemech primerů. Pro zajištění přesnosti změřte celkový objem primerů v kazetě pipetou před zahájením přípravy.

Každý sekvenátor Illumina® má různou konečnou koncentraci a celkový objem, proto si přečtěte dokument níže, abyste zajistili, že se přímo přidá vhodné množství sekvenačních primerů TELL-Seq™ Illumina®.

*Poznámka: Primery Index 1 a Index 2 se spolu s primery Read 1 a Read 2 často smíchají v jamce reagenční kazety. Ujistěte se, že konečná koncentrace primeru pro jamku je rovna koncentraci každého primeru (např. 0.3M Indexu 1 a Indexu 2, celkem 0.6M).https://knowledge.illumina.com/library-preparation/general/library-preparation-general-reference_material-list/000001542>

Níže jsou uvedeny

iSeq100
Vzhledem ke konstrukci kazety iSeq100 není možné vkládat a používat vlastní primery.

MiniSeq 

DalšíSeq 

DalšíSeq 

* Neexistuje žádná možnost pro vlastní primer Index 2 (i5), protože šablona používá naroubovaný primer P5 na povrchu průtokové cely.

HiSeq 1000/2000 – 1500/2300 

* Neexistuje žádná možnost pro vlastní primer Index 2 (i5), protože šablona používá naroubovaný primer P5 na povrchu průtokové cely.

HiSeq 3000/4000 

Spotřební materiál NovaSeq v1.0

Kit verze	Illumina Primer (jméno)	Kazeta Pozice	Celkový Objem (ml)	Zvyk základní nátěr finále koncentrace (µM)
SP100/200/300/500 cykly	Přečíst 1 (BP10)	24	4	0.3
	Index 1 (i7) (BP14)*	23	5	0.3
	Přečíst 2 (BP11)	13	2	0.3
S1 a S2 100/200/300 cyklů	Přečíst 1 (BP10)	24	4	0.3
	Index 1 (i7) (BP14)*	23	5	0.3
	Přečíst 2 (BP11)	13	2	0.3
S4200/300 cykly	Přečíst 1 (BP10)	24	7.3	0.3
	Index 1 (i7) (BP14)*	23	5	0.3
	Přečíst 2 (BP11)	13	3.5	0.3

* Neexistuje žádná možnost pro vlastní primer Index 2 (i5), protože šablona používá naroubovaný primer P5 na povrchu průtokové cely.

 

Spotřební materiál NovaSeq v1.5

Kit verze	Illumina Primer (jméno)	Kazeta Pozice	Celkový Objem (ml)	Zvyk základní nátěr finále koncentrace (µM)
SP100/200/300/500 cykly	Přečíst 1 (VP10)	24	4	0.3
	Index 1 (i7) a Index 2 (i5) (VP14)	23	5	0.3
	Přečíst 2 (VP11)	13	2	0.3
S1 a S2 100/200/300 cyklů	Přečíst 1 (VP10)	24	4	0.3
	Index 1 (i7) a Index 2 (i5) (VP14)	23	5	0.3
	Přečíst 2 (VP11)	13	2	0.3
S4200/300 cykly	Přečíst 1 (VP10)	24	7.3	0.3
	Index 1 (i7) a Index 2 (i5) (VP14)	23	5	0.3
	Přečíst 2 (VP11)	13	3.5	0.3

NovaSeq X/X Plus 

Nastavení běhu TELL-Seq™ na systému NextSeq™ 1000/2000

Zásobník s reagenciemi NextSeq™ 1000/2000 má dvě vlastní jamky (1 a 2, obě jsou prázdné), které lze použít, když knihovna vyžaduje alespoň jeden vlastní primer. Podporuje až dva vlastní primery (pool) pro každou vlastní jamku. Je nezbytné, aby Read primer a Index primer byly v různých jamkách. Knihovny TELL-Seq™ vyžadují pro všechna čtení (čtení 1, čtení 2, index 1 a index 2) vlastní primery.

Pokud jsou v rámci cyklu sekvenovány pouze knihovny TELL-Seq™

• Zkombinujte primery TELL-Seq™ read 1 a read 2: použijte HT1 k naředění každé vlastní čtené směsi primerů, abyste získali 600 µl při konečné koncentraci 0.3 µM, tj. 1.8 µl 100 µM TELL-Seq™ read 1 primeru a 1.8 µl 100 µM TELL-Seq™ odečtěte primer 2 do 597 ul HT1. Vložte jej do vlastní studny 1.
• Kombinujte primery TELL-Seq™ index 1 a index 2: použijte HT1 k naředění každé směsi primerů s vlastním indexem tak, abyste získali 600 µl při konečné koncentraci 0.6 µM, tj. 3.6 µl 100 µM primeru TELL-Seq™ index 1 a 3.6 µl 100 uM TELL-Seq™ index 2 primeru do 593 ul HT1. Vložte jej do vlastní studny 2.

Při nastavování běhu sekvenování vyberte správný vlastní primer následovně:

• Číst 1: Vlastní
• 1 Index
• 1: Vlastní
• 2 Index 2: Vlastní
• 2 Čtení 2: Vlastní 1

Když jsou knihovny PhiX použity s knihovnami TELL-Seq™ pro sekvenování v běhu

• Získejte NextSeq 1000/2000 Read Primer Kit (katalogové č. 20046117)
• Zkombinujte TELL-Seq™ read 1 a read 2 primery do HP21: Přidejte každou vlastní čtenou směs primerů do 600 µl HP21 pro konečnou koncentraci 0.3 µM, tj. 1.8 µl 100 µM TELL-Seq™ read 1 primeru a 1.8 µl 100 uM TELL-Seq™ odečtěte primer 2 do 597 ul HP21. Vložte jej do vlastní studny 1.
• Kombinujte primery TELL-Seq™ index 1 a index 2: použijte HT1 k naředění každé směsi primerů s vlastním indexem tak, abyste získali 600 µl při konečné koncentraci 0.6 µM, tj. 3.6 µl 100 µM primeru TELL-Seq™ index 1 a 3.6 µl 100 uM TELL-Seq™ index 2 primeru do 593 ul HT1. Vložte jej do vlastní studny 2.

Při nastavování běhu sekvenování vyberte správný vlastní primer, a to následovně:

• Číst 1: Vlastní
• 1 Index 1: Vlastní
• 2 Index 2: Vlastní
• 2 Čtení 2: Vlastní 1

Když jsou duální indexové knihovny Illumina sekvenovány s knihovnami TELL-Seq™ společně v běhu

• Získejte NextSeq 1000/2000 Read & Index Primer Kit (katalogové č. 20046115)
• Zkombinujte TELL-Seq™ read 1 a read 2 primery do HP21: Přidejte každou vlastní čtenou směs primerů do 600 µl HP21 pro konečnou koncentraci 0.3 µM, tj. 1.8 µl 100 µM TELL-Seq™ read 1 primeru a 1.8 µl 100 uM TELL-Seq™ odečtěte primer 2 do 597 ul HP21. Vložte jej do vlastní studny 1.
• Zkombinujte primery TELL-Seq™ index 1 a index 2 do BP14: Přidejte každou směs vlastních indexových primerů do 600 ul BP14 pro konečnou koncentraci 0.6 µM, tj. 3.6 µl 100 µM TELL-Seq™ indexu 1 primeru a 3.6 µl 100 uM TELL-Seq™ index 2 primeru do 593 ul BP14. Vložte jej do vlastní studny 2.
• Při nastavování běhu sekvenování vyberte správný vlastní primer, a to následovně:
• Přečtěte si 1: Vlastní 1
  Index 1: Vlastní
• 2 Index 2: Vlastní
• 2 Čtení 2: Vlastní 1

Často kladené otázky

• Otázka: Co se stane, když sekvence Indexu 1 nebudou kompletně sekvenovány?
  A: Neúplné sekvenování Indexu 1 může vést k chybám v následné analýze a interpretaci dat. Pro přesné výsledky je zásadní zajistit úplné sekvenování Indexu 1.
• Otázka: Potřebuji pro všechny systémy Illumina vlastní sekvenční primery?
  A: Ano, pro sekvenování knihoven TELL-Seq™ na všech systémech Illumina s výjimkou iSeq 100 jsou vyžadovány vlastní sekvenční primery. Primery TheN jsou součástí sady sekvenčních primerů TELL-Seq™ Illumina.

Dokumenty / zdroje

UNIVERZÁLNÍ SEKVENOVÁNÍ 100018-USG TELL Seq Library Sequencing [pdfUživatelská příručka 100018-USG TELL Seq knihovní sekvenování, 100018-USG, TELL Seq knihovní sekvenování, sekvenování Seq knihovny, sekvenování knihovny, sekvenování

Reference

• Uživatelská příručka