opentrons OT-2 pracovní stanice pro instrukce efektivní laboratorní automatizace

Přípravný list
Měření a statistická analýza

Autorem je Kennedy Bae, Ph.D. a Kinnari Watson, Ph.D.

Začínáme

Před výukou plánu lekce proveďte před lekcí následující kroky.

Rozbalte OT-2
Nastavte aplikaci Opentrons
Připojte pipety
Zkalibrujte palubu
Kalibrujte délku špičky a offset pipety
Importujte všechny související protokoly do aplikace
Otestujte protokol na OT-2

Potřebujete další podporu?

Pro technickou podporu se prosím podívejte na naše Centrum nápovědy Opentrons pro relevantní články. Pokud potřebujete další podporu, kontaktujte nás podpora@opentrons.com.

Máte-li dotazy týkající se plánu lekce, obraťte se na autory, Kennedy Bae, na adrese kennedy@opentrons.com, nebo Kinnari Watson, at kinnari@opentrons.com.

Průvodce pro pedagogy
Měření a statistická analýza

Autorem je Kennedy Bae, Ph.D. a Kinnari Watson, Ph.D.

Účel

Tato laboratoř si klade za cíl rozvinout u studentů porozumění používání sériových ředění k vytvoření standardní křivky a použití standardních křivek pro interpolaci sample hodnoty. To zahrnuje ocenění:

• Základní dovednosti v pipetování
• Sériová ředění
• Měření replikátů
• Rozsah standardní křivky
• Využití statistik k posouzení významnosti

Studenti provádějí ruční pipetování paralelně s automatizovanou manipulací s kapalinami, což studentům umožňuje vidět silné stránky a příležitosti obou technik.

Studentské publikum

Tato laboratoř byla navržena pro použití při vstupu do středoškolských kurzů biologie. Je flexibilní, aby vyhovoval libovolnému počtu studentů, kteří jsou zapsáni ve třídě.

Základní znalosti

Studenti by měli mít koncepční porozumění pipetování, spektrofotometrii, standardním křivkám a statistické analýze.

Základní kompetence

Laboratorní dovednosti
Pipetování, samppříprava le a použití laboratorních automatizačních zařízení

Analýza dat
Vytváření standardních křivek, interpolace a statistické analýzy

Kritické myšlení
Interpretace experimentálních dat, řešení problémů a vyvozování rozumných závěrů

Dodávky

Protokol Opentrons

Stáhněte si protokol z
https://protocols.opentrons.com/protocol/customizable_s erial_dilution_ot2

• Vyberte následující parametry na webstránka podle vašeho nastavení a spotřebního materiálu:
  • Typ pipety
  • Mount Side
  • Typ hrotu
  • Typ žlabu
  • Typ desky
• Ponechte výchozí nastavení pro:
  • Faktor ředění (3)
  • Počet ředění (10)
  • Celkový objem míchání (150)
  • Prázdná deska s jamkami (ano)
  • Strategie používání spropitného (použijte jeden tip)
  • Objem vzduchové mezery (10)

Zařízení Opentrons

Automatizovaný robot pro manipulaci s kapalinami Opentrons OT-2
Opentrons p300 8kanálová pipeta

Zařízení bez Opentronů

Deskový spektrofotometr
Software pro analýzu dat (např. Excel nebo specializovaný statistický software)
Ruční pipety s proměnným objemem P1000 (jedna na studenta)
Ruční pipeta s proměnným objemem P100 (vyžaduje se pouze jedna, pro předvedení části A)

Labware

Stojan na špičky Opentrons 300 μL
12-ti jamkové koryto
96jamková destička s plochým dnem
Zkumavky (6 na studenta)
Kapátko (1 na studenta)

Reagencie

1000 ml diH20 na studenta
FD&C Blue č. 1 (při vývoji této laboratoře byl použit McCormick®)

Doba trvání experimentu

Požadované kurzy
1

Doba běhu laboratoře
Odhadovaný celkový čas: 2.5-3 hodiny
Úvod a generování kalibrační křivky: 35 minut
SampPříprava a pipetování: 1 hodina
Sběr dat: 30 minut

Základní odstraňování problémů

1. Proveďte zkušební jízdu před lekcí; tímto způsobem lze vyřešit jakékoli neočekávané události před příjezdem studentů.
2. Problémy s narážejícími hroty na destičky jsou téměř vždy způsobeny použitím alternativního laboratorního vybavení nebo kalibrace robota. Pokud se s tím setkáte a máte potvrzený správný laboratorní software, zkuste robota znovu zkalibrovat.
3. Pokud se potřebujete obrátit na podporu Opentrons, informujte ji prosím, že jste součástí našeho programu Opentrons for Education, a o datu vaší příští laboratorní hodiny.

Požadované předlaboratorní činnosti

Před zahájením tohoto cvičení by studenti měli mít následující technické schopnosti a teoretické znalosti:

• Naložte špičku pipety na ruční pipetu
• Nastavení objemu pro ruční pipety
• Teoretické znalosti spektrofotometrie - Pedagog bude provozovat spektrofotometr pro tuto laboratoř
• Pochopení standardních křivek, včetně znalosti rovnice, která křivku definuje, a schopnosti interpolovat hodnoty
• Silná znalost základní statistické analýzy, včetně výpočtu a interpretace průměrů, směrodatných odchylek a R²

Průvodce postupem

1. Úvod do laboratoře ~ 15 minut

V ideálním případě by si studenti měli před příchodem do třídy přečíst laboratorního průvodce, ale plánujte strávit 10 minut diskusí o technikách pipetování.view standardních křivek a interpolace sample hodnoty.

2. Generování kalibrační křivky ~ 20 minut

Dále předveďte generování standardní křivky (část A) pro třídu (tato laboratoř předpokládá, že pedagog bude jediným operátorem robota OT-2 a spektrofotometru):

1. Připravte roztok modrého barviva s 50 μl modrého potravinářského barviva a 10 ml diH2O.
2. Přidejte 200 μl roztoku modrého barviva do jamek A1-H1 96jamkové destičky s plochým dnem.
3. Přidejte 20 ml vody do jamky A1 žlabu.
   (Poznámka: Sloupec po posledním ředění je výchozím umístěním slepých vzorků. Poslední jamka žlabu/zásobníku je výchozím tekutým odpadem.)
4. Uspořádejte laboratorní software následovně:
   A. Slot 1 = Opentrons 300 μL stojan na špičky
   b. Slot 2 = 12kanálový zásobník
   C. Slot 3 = 96-jamková destička s plochým dnem
5. Pro spuštění protokolu přejděte do aplikace pro spuštění OT-2.
6. Kvantifikujte absorbanci 96jamkové destičky při 450 nm.

3. Diskuse ~ 5 minut

Po provedení sériových ředění a vygenerování standardní křivky se možná budete chtít vrátit jako třída a prodiskutovat silné stránky a příležitosti automatizace.

4. Část B: Manuál Sample Příprava ~ 1 hodina

Během této části cvičení budou studenti požádáni, aby samostatně dokončili část B cvičení:

1. Použijte jednu zkumavku k odběru 200 μl alikvotu koncentrovaného barviva.
2. Pomocí druhé zkumavky odeberte 4 ml ředidla (diH2O).
3. Do každé ze 800 zbývajících zkumavek napipetujte alespoň 20 μl diH4. Tyto se stanou vaším samples.
4. Použijte kapátko k dávkování různého množství koncentrovaného barviva do každého sample trubice.
5. Napipetujte 200 μl svého prvního sample do jamky 96-jamkové destičky. Opakujte to ještě 3krát, abyste měli 4 repliky tohoto sample ve 4 jamkách destičky. Zapište, do kterých jamek jste umístili toto sample into (pravděpodobně budete svůj 96jamkový talíř sdílet s ostatními studenty – chcete vědět, které sampjsou vaše!).
6. Opakujte výše uvedený krok po zbývající 3 samples. Měli byste 4 jamky z každého sample, pro celkem 16 jamek, naplněných do 96-jamkové destičky.
7. Kvantifikujte absorbanci 96jamkové destičky při 450 nm.

Zatímco studenti dokončí část B, naplánujte si obíhat po laboratoři, abyste odpovídali na otázky a pozorovali studentovu techniku ​​pipetování, připomínali studentům, aby zaznamenali, které studny používají, a podle potřeby jim poskytněte individuální pomoc.

5. Sběr dat ~ 30 minut

Počkejte 30 minut na sběr dat.

6. Rozpis ~ 10 minut

Na konci laboratoře si ponechte čas na stručné představení zprávy z laboratoře a poskytněte studentům dostatek času na úklid svých stanovišť a kladení zbývajících otázek.

Laboratorní zpráva

Instrukce

Zadejte studentům, aby připravili komplexní laboratorní zprávu, která bude obsahovat data kalibrační křivky, interpolované sample a statistickou analýzu. Poskytněte pokyny pro strukturu sestav a prezentaci dat. Některé nápady na průzkum jsou uvedeny níže.

• Stanovte standardní křivku
  • Agregujte jednotlivé hodnoty pro vaše standardy.
  • Najděte průměr a standardní odchylku v každé z nich.
  • K definování standardní křivky použijte střední hodnoty.
  • Určete, jak dobře vypočtená křivka odpovídá datovým bodům, výpočtem hodnoty R2. Připomeňme, že čára, která dokonale odpovídá datovým bodům, má hodnotu R2 1. Je důležité vytvořit novou standardní křivku s vypočítanou hodnotou R2 pro každý experiment.
• Interpolace Sample Hodnoty
  • Použijte svou vypočítanou standardní křivku k interpolaci sample hodnoty ručně.
  • Jaká je směrodatná odchylka mezi replikacemi každého z vašich s?amples?
  • Jaké jsou možné důvody tohoto rozdílu?
  • Jaké jsou výhody měření replikací?
• Jaké trendy můžete pozorovat mezi různými sadami samples? Jsou některé z pozorovaných rozdílů statisticky významné?
  • Existují nějaké odlehlé hodnoty? Jak použití statistik umožňuje posouzení odlehlých hodnot vs. třešňových údajů?

Průvodce pro studenty
Měření a statistická analýza

Účel

Tato laboratoř rozvine vaše znalosti o používání sériových ředění k vytvoření standardní křivky a použití standardních křivek pro interpolaci sample hodnoty. To zahrnuje ocenění:

• Základní dovednosti v pipetování
• Sériová ředění
• Měření replikátů
• Rozsah standardní křivky
• Využití statistik k posouzení významnosti

V této laboratoři studenti využijí data získaná ručním pipetováním a také automatickým manipulátorem kapalin OT-2, což studentům umožní vidět silné stránky a možnosti obou technik.

Požadované vybavení

• Automatizovaný robot pro manipulaci s kapalinami Opentrons OT-2
• Opentrons p300 8kanálová pipeta
• Stojan na špičky Opentrons 300 μL
• Ruční pipeta (P1000)
• 12-ti jamkové koryto
• 96jamková destička s plochým dnem
• 1000 ml deionizované vody (diH2O)
• FD&C Blue č. 1 (při vývoji této laboratoře byl použit McCormick®)
• 6 zkumavek
• Kapátko

Experimentální postup

Část A: Pozorovat Generování standardní křivky

OT-2 provede automatické pipetování sériových ředění. Když váš pedagog změří tyto standardy spektrofotometrem, bude schopen vytvořit standardní křivku.

Váš pedagog bude postupovat podle těchto pokynů, aby připravil a provozoval robota OT-2. Kroky 1-4 budou dokončeny ručně (vaším pedagogem nebo dobrovolníky studentů) před spuštěním automatizovaných kroků robota OT-2:

1. Připravte roztok modrého barviva s 50 μl modrého potravinářského barviva a 10 ml diH2O.
2. Přidejte 200 μl roztoku modrého barviva do jamek A1-H1 96jamkové destičky s plochým dnem.
3. Přidejte 20 ml vody do jamky A1 žlabu.

(Poznámka: Sloupec po posledním ředění je výchozím umístěním slepých vzorků. Poslední jamka žlabu/zásobníku je výchozím tekutým odpadem.)

4. Uspořádejte laboratorní software následovně:

ο Slot 1 = Opentrons 300 μL stojan na špičky
ο Slot 2 = 12kanálový zásobník
ο Slot 3 = 96-jamková destička s plochým dnem

5. Pokračujte do aplikace OT-2 run a spusťte automatický protokol.

ο Stáhnout protokol z
https://protocols.opentrons.com/protocol/customiza ble_serial_dilution_ot2

• Vyberte následující parametry na webstránka podle vašeho nastavení a spotřebního materiálu:
  • Typ pipety
  • Mount Side
  • Typ hrotu
  • Typ žlabu
  • Typ desky
• Ponechte výchozí nastavení pro:
  • Faktor ředění (3)
  • Počet ředění (10)
  • Celkový objem míchání (150)
  • Prázdná deska s jamkami (ano)
  • Strategie používání spropitného (použijte jeden tip)
  • Objem vzduchové mezery (10)

6. Kvantifikujte absorbanci 96-jamkové destičky při 450 nm.

Poznámka: Sériová ředění se provádějí postupným převedením alikvotů standardu do zvyšujícího se množství ředidla (viz diagram). OT-2 nasaje alikvot koncentrovaných standardů a nadávkuje je do ředidla. Poté promíchá koncentrované barvivo a ředidlo opakovaným pipetováním kapaliny nahoru a dolů. Poté robot nasaje alikvot prvního smíchaného standardu a nadávkuje jej do dalšího sloupce ředidla.

Část B: Chování Manuál Sample Příprava

1. Použijte jednu zkumavku k odběru 200 μl alikvotu koncentrovaného barviva.
2. Pomocí druhé zkumavky odeberte 4 ml ředidla (diH2O).
3. Do každé ze 800 zbývajících zkumavek napipetujte alespoň 20 μl diH4. Tyto se stanou vaším samples.
4. Vytváření různých samps různým množstvím koncentrátu a ředidla: Použijte kapátko k dávkování různého množství koncentrovaného barviva do každého sample trubice.
5. Napipetujte 200 μl svého prvního sample do jamky 96-jamkové destičky. Opakujte to ještě 3krát, abyste měli 4 repliky tohoto sample ve 4 jamkách destičky. Zapište, do kterých jamek jste umístili toto sample into (pravděpodobně budete svou 96jamkovou desku sdílet s ostatními studenty, o kterých chcete vědět, které sampjsou vaše!).
6. Opakujte kroky 5 a 6 po zbývající 3 samples, takže skončíte se 4 replikáty každého sample ve 4 jamkách. Měli byste 4 jamky z každého sample, pro celkem 16 jamek, naplněných do 96-jamkové destičky.
7. Kvantifikujte absorbanci 96jamkové destičky při 450 nm.

Studentský kvíz
Měření a statistická analýza

Studentský kvíz

1. Jaká je výhoda použití sériového ředění k vytvoření standardní křivky?
2. Proč je při biologických měřeních důležité generování kalibračních křivek?
3. Jmenujte jeden potenciální problém při generování kalibračních křivek a navrhněte řešení.
4. Popište roli zařízení používaného v této laboratoři.
5. Jaké jsou běžné zdroje variability ručního pipetování?
6. Proč je užitečné měřit repliky každého sample?
7. Jaký je účel interpolace samphodnoty le v tomto experimentu?
8. Jak může statistická analýza pomoci interpretovat rozdíly mezi různými samples?
9. Jak mohou být poznatky z této laboratoře relevantní pro biologický výzkum?

Dokumenty / zdroje

opentrons OT-2 pracovní stanice pro efektivní laboratorní automatizaci [pdfPokyny Pracovní stanice OT-2 pro efektivní automatizaci laboratoří, OT-2, Pracovní stanice pro efektivní automatizaci laboratoří, Efektivní automatizace laboratoří, automatizace laboratoří, automatizace

Reference

• Uživatelská příručka