Uživatelská příručka robota pro manipulaci s kapalinami Opentrons OT-2

Dnešním cílem je, aby studenti identifikovali kolonie, které obsahují správně sestavenou plazmidovou DNA pomocí PCR, která je implementována v robotu OT-2 pro manipulaci s kapalinami a Návrhář protokolu Opentrons.
K tomu budou studenti potřebovat:

Identifikujte primery, které budou amplifikovat fragment překlenující spojení mezi vektorovou kostrou a insertem
Seznamte se s manuálem protokolu pro screening kolonií E. coli PCR

K vytvoření protokolu pro screening kolonií OT-2 E. coli PCR použijte Protocol Designer

Studentské publikum

Tato laboratoř byla navržena pro vysokoškolské studenty střední až vyšší úrovně na vysoké škole inženýrství biologických systémů na Virginia Tech (BSE 3984).
Laboratoř může pojmout většinu velikostí tříd, protože protokol OT-2 bude řídit instruktor, nikoli jednotliví studenti.

Základní znalosti

Studenti by měli přijít do laboratoře s koncepčním pochopením ručního pipetování, screeningu kolonií, DNA ampliﬁkace a průběh/interpretace výsledků gelové elektroforézy.

Základní kompetence

Laboratorní dovednosti
Pipetování, samppříprava le a použití laboratorních automatizačních zařízení
Kritické myšlení
Interpretace výsledků gelové elektroforézy, odstraňování problémů, navrhování automatizace pro efektivitu, zvažování přístupů k automatizaci

Dodávky

Zařízení Opentrons

P20 Jednokanálový GEN2

P300 Jednokanálový GEN2
Stojan na hroty Opentrons 96 20 µL

Stojan na hroty Opentrons 96 300 µL
Ohřívač-třepačka GEN1

96jamková destička NEST 100 µL PCR Full Skirt
Stojan na zkumavky Opentrons 24 s Eppendorfem 1.5 ml
Safe-Lock Snapcap

Reagencie

DI voda

OneTaq® 2X PCR Master Mix se standardním pufrem
Dopředný primer 1

Reverzní primer 1
Dopředný primer 2

Reverzní primer 2

Doba trvání experimentu

Požadované lekce 1
Doba běhu laboratoře
Odhadovaná celková doba: 2.5-3 hodiny

Nadview a Review ručního protokolu (první část): 10 minut
Vypracování protokolu OT-2 na Opentrons Protocol Designer (část druhá): 35 minut

Prezentace protokolů, rozhodování o konsensuálním protokolu: 15 minut
Protokol běhu, Colony Dip, PCR jako třída (část třetí): 1.5 hodiny

Základní odstraňování problémů

Proveďte zkušební jízdu před lekcí; tímto způsobem lze vyřešit jakékoli neočekávané události před příjezdem studentů.
Problémy s narážejícími hroty na desky jsou téměř vždy způsobeny použitím alternativního laboratorního vybavení nebo kalibrace robota. Pokud se s tím setkáte a potvrdili jste správný laboratorní software, zkuste robota znovu zkalibrovat.

Pokud se potřebujete obrátit na podporu Opentrons, informujte ji prosím, že jste součástí našeho programu Opentrons for Education, a o datu vaší příští laboratorní hodiny.

Požadované předlaboratorní činnosti

Před tímto cvičením by studenti měli mít následující technické schopnosti a teoretické znalosti:

Naložte špičku pipety na ruční pipetu
Nastavení objemu pro ruční pipety
Teoretické znalosti DNA ampliﬁkace a gelová elektroforéza

Průvodce postupem

Nadview a Review ručního protokolu (první část) ~ 10 minut
Studenti by si měli před příchodem do třídy přečíst laboratoř, ale naplánujte si, že si vyhradíte chvíli na to, abyste nastínili laboratorní cvičení, vysvětlili účel a odpověděli na otázky studentů.
Manuální protokol PCR kolonií pro screening E. coli studenti začlení automatizaci do následujícího:
Připravte PCR master mix:
1. Vypočítejte objem každého mastermixu, který se má vytvořit pomocí Kalkulačka PCR kolonií E. coli.
2. Pomocí sloupce „ul for master mix“ přidejte vypočítané množství každého činidla do každé master mix v 1.5 ml zkumavce.
3. Do každé jamky stripu nebo destičky alikvotujte 20 µl master mixu.
Colony dip a spusťte PCR (Upozorňujeme, že v našem aktuálním OT-2 neexistuje způsob, jak tyto kroky automatizovat):
4. Odeberte velmi malé množství kolonie z misky a ponořte ji do první zkumavky PCR.
5. Opakujte pro každou ze zbývajících zkumavek PCR s použitím nové špičky pro každou kolonii.
6. Uzavřete zkumavky PCR, přesuňte je do termocykleru a spusťte příslušný protokol.
Vypracování protokolu OT-2 na Opentrons Protocol Designer (část druhá) ~ 35 minut
Každý student použije Návrhář protokolu Opentrons k vytvoření jejich protokolu pomocí následujících pokynů:
1. Budete instruováni, abyste popsali požadované nastavení robota, jaké nástroje a díly budete potřebovat a kam jdou. Toto je „File“ na levé straně.
2. Poté budete požádáni, abyste popsali kapaliny zahrnuté v protokolu. Musí to být pouze výchozí tekutiny, ne nic, co budete vyrábět.
3. Nakonec budete muset určit, kam budou všechny kapaliny přesunuty, aby bylo možné provést požadovaný protokol, „Navrhnout“ váš protokol.
Během této části laboratoře si naplánujte individuální přihlášení se studenty a uvidíte, jak spolu vycházejí. Připomeňte jim, aby mysleli efektivně a vyhýbali se potenciální křížové kontaminaci.
Prezentace protokolů, rozhodování o konsensuálním protokolu ~ 15 minut
Studenti by měli stručně představit své protokoly spolu s jejich zdůvodněním. Jako třída studenti identifikují konsensuální protokol, který má vést instruktor.
Naplánujte si, že během této doby vytvoříte prostor pro zdravou debatu a kritické myšlení.
Provozní protokol, Colony Dip, PCR jako třída (část třetí) ~ 1.5 hodiny
Jakmile se třída rozhodne pro konsenzuální protokol, spustíte protokol, kolonie dip a PCR.
Můžete se rozhodnout učinit tuto sekci poutavější tím, že vychujete dobrovolníky ze studentů, kteří budou dělat různé části této laboratoře.
A zatímco probíhá PCR, můžete se rozhodnout, že budete ve třídě diskutovat o nevýhodách a příležitostech automatizace, odpovídat na otázky nebo umožnit studentům pracovat na laboratorní zprávě v malých skupinách.

Laboratorní zpráva

Instrukce
Zadejte studentům, aby připravili komplexní laboratorní zprávu, která jim pomůže reflektovat jejich výsledky a automatizaci OT-2. Některé nápady na průzkum jsou uvedeny níže:

Aktivita míchání kódu: Když jste otevřeli dveře, všechny stránky kódu Opentrons vyletěly z vašeho stolu!
Zjistěte, co se děje na každé stránce kódu, a poté je dejte zpět ve správném pořadí.
a. Modrý
b. Zelený
c. Červený
Vraťte se zpět k protokolu OT-2, který jste připravili. Dokážete identifikovat nějaké příležitosti, jak zefektivnit vaši automatizaci?
Identifikujte několik kritických bodů ve svém protokolu, kde by se během automatizace mohlo něco pokazit (např. křížová kontaminace nebo nedostatek činidla). Jak byste je mohli řešit?
Review a připojte obrázek výsledků gelové elektroforézy k této laboratoři. Jak interpretujete tyto výsledky?

Studentský průvodce PCR kolonie Screening

Účel
Vaším dnešním cílem je identifikovat kolonie, které obsahují správně sestavenou plazmidovou DNA pomocí PCR, která je implementována v robotu manipulujícím s kapalinami OT-2 a protokolu Opentrons.
Návrhář.
K tomu budete potřebovat:

Identifikujte primery, které budou amplifikovat fragment překlenující spojení mezi vektorovou kostrou a insertem

Seznamte se s manuálem protokolu pro screening kolonií E. coli PCR
K vytvoření protokolu pro screening kolonií OT-2 E. coli PCR použijte Protocol Designer

Požadované vybavení
Pipety a tipy:

P20 Jednokanálový GEN2
P300 Jednokanálový GEN2
Stojan na hroty Opentrons 96 20 µL

Stojan na hroty Opentrons 96 300 µL

Moduly a Labware:

Ohřívač-třepačka GEN1

96jamková destička NEST 100 µL PCR Full Skirt
Stojan na zkumavky Opentrons 24 s Eppendorf 1.5 ml Safe-Lock Snapcap

Činidla:

DI voda
OneTaq® PCR master mix
Dopředný primer 1

Reverzní primer 1
Dopředný primer 2
Reverzní primer 2

Experimentální postup
Pozadí
Abychom provedli PCR na DNA v E. coli a většině ostatních bakterií, stejně jako savčích buňkách, stačí vložit několik buněk organismu do PCR a počáteční denaturační krok rozruší buňky a uvolní DNA. Nejběžnějším problémem, který se u tohoto protokolu vyskytuje, je to, že do reakce vložíte příliš mnoho buněk a je zde příliš mnoho nespecifické DNA a dalších molekul, které mohou interferovat s polymerázou. Jiné organismy jako houby a rostliny obsahují tolik rušivého materiálu, jmenovitě jejich buněčné stěny, že je zapotřebí přísnější lýza. Obvykle provádíme buď několik cyklů zmrazování a rozmrazování, lýzu hydroxidem sodným nebo mletí kapalným dusíkem, abychom uvolnili DNA z těchto obtížnějších organismů.
Bez ohledu na to, hlavním bodem je, že nepotřebujete mnoho buněk, abyste měli v reakci mnoho DNA. Ve skutečnosti u E. coli nechcete, aby buněčný roztok, který plánujete lyzovat a použít pro PCR, byl zakalený nebo „zakalený“ v mikrobiologickém žargonu. Sotva byste měli vidět, jak se buňky rozptylují do roztoku.
Mikrobiologové obvykle připraví reakční směs PCR jako hlavní směs (se všemi reakcemi potřebnými v jedné zkumavce) a poté alikvotují tuto hlavní směs do jednotlivých zkumavek. Nepotřebujete velký objem, 20 µl je obecně dostačujících k tomu, abyste viděli proužek, zvláště pokud při nalévání gelu používáte hřeben s úzkými jamkami. Poté ponořte špičku s malým množstvím kolonie do každé zkumavky PCR a jemně ji zamačkejte. (Rada: Ponechte špičku v roztoku, dokud není sběr kolonií dokončen, abyste neztratili své místo v misce nebo proužku zkumavek.)
Dnes budeme používat dvě různé sady primerů k detekci správného sestavení našich plazmidů pro 15 různých kolonií a také negativní kontrolu, náš plazmid, který jsme použili pro páteř.
Bude to celkem 32 různých PCR. I když není strašné vytvářet PCR kolonií, můžete začít vidět, jak v tomto měřítku je pipetování únavné a udělat chybu by bylo snadné. Metoda master mixu rozhodně pomáhá, ale u méně opakujících se věcí hodně pomáhá Opentrons. Vytvoření tohoto protokolu v OT-2 bude doufejme velmi dosažitelným, ale názorným protokolem, který vám představí automatizaci laboratoře.

Část první: ReviewManuální protokol pro screening kolonií E. coli PCR
Vaším cílem v této laboratoři je vytvořit automatický protokol Opentrons OT-2, který bude replikovat následující manuální protokol PCR kolonií E. coli:
Připravte PCR master mix:

Vypočítejte objem každého mastermixu, který chcete vytvořit pomocí Kalkulačka PCR kolonií E. coli.

Pomocí sloupce „ul for master mix“ přidejte vypočítané množství každého činidla do každé master mix v 1.5 ml zkumavce.
Do každé jamky stripu nebo destičky alikvotujte 20 µl master mixu.
Colony dip a spusťte PCR (Upozorňujeme, že v našem aktuálním OT-2 neexistuje způsob, jak tyto kroky automatizovat):
Odeberte velmi malé množství kolonie z misky a ponořte ji do první zkumavky PCR.

Opakujte pro každou ze zbývajících zkumavek PCR s použitím nové špičky pro každou kolonii.
Uzavřete zkumavky PCR, přesuňte je do termocykleru a spusťte příslušný protokol.

Část druhá: Vytvoření protokolu OT-2
Chcete-li vytvořit protokol, otevřete soubor Návrhář protokolu Opentrons.

Budete instruováni, abyste popsali požadované nastavení robota, jaké nástroje a díly budete potřebovat a kam jdou. Toto je „File“ na levé straně.
Poté budete požádáni, abyste popsali kapaliny zahrnuté v protokolu. Musí to být pouze výchozí tekutiny, ne nic, co budete vyrábět.(Všimněte si, že k vytvoření těchto různých primerů můžete použít zaškrtávací políčko 'Serializovat' v návrháři protokolu. Také si uvědomte, že při zadávání objemů to můžeme později změnit, jen se ujistěte, že objem, který zadáte, dává smysl a přesahuje to, co myslíš, že budeš potřebovat.)
Nakonec budete muset určit, kam budou všechny kapaliny přesunuty, aby bylo možné provést požadovaný protokol, „Navrhnout“ váš protokol.
Při vývoji svého protokolu OT-2 přemýšlejte o tom, jak jej maximálně zefektivnit. Podívejte se na pokročilá nastavení pod „ikonou ozubeného kola“. Pro uložení tipů můžete také použít různé cesty. Buďte opatrní a ujistěte se, že neznečistíte činidla nebo nezničíte
náš experiment s křížovou kontaminací. V tomto duchu se také snažte zamyslet nad věcmi, které by se mohly pokazit, jako je nedostatek reagencie, a ujistěte se, že je zdokumentujete, protože to může být užitečné při ladění vašeho protokolu a zajištění toho, aby koncový uživatel věděl o kritických bodech ve vašem protokol.
Software může chvíli trvat, než si na něj zvyknete, ale můžete si na něj kliknout a zvyknout si na něj docela rychle a nakonec je docela intuitivní. Jak uvidíte, vyžaduje to hodně klikání, abyste specifikovali protokol, který by možná mohl být užitečnější, kdyby byl napsán v Pythonu a dal by se snadno upravit a přidat sampnebo nová činidla.
Po dokončení protokolu se vraťte na „File“ a exportujte jej. To vám umožní jej později importovat nebo nahrát do OT-2.

Jako třída každý student stručně představí svůj protokol a společně rozhodneme o závěrečném protokolu třídy, který bude spuštěn na OT-2.

Začínáme
Před výukou plánu lekce proveďte před lekcí následující kroky.

Rozbalte OT-2

Potřebujete další podporu?

Pro technickou podporu se prosím podívejte na naše Centrum nápovědy Opentrons pro relevantní články. Pokud potřebujete další podporu, kontaktujte nás podpora@opentrons.com.
Pokud máte dotazy týkající se plánu lekce, kontaktujte nás
autor, Clay Wright, Ph.D., at wrightrc@vt.edu.

Dokumenty / zdroje

Robot pro manipulaci s kapalinami Opentrons OT-2 [pdfUživatelská příručka
OT-2, OT-2 robot pro manipulaci s kapalinami, robot pro manipulaci s kapalinami, manipulační robot, robot

Reference

Uživatelská příručka

Robot pro manipulaci s kapalinami OT-2

Účel